实时定量PCR定量方法

在实时荧光定量PCR中，模板定量有绝对定量和相对定量两种。

1.绝对定量 是借助已知浓度（或拷贝数）的标准品来定量。将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应，以标准品拷贝数的对数和CT值绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。与传统的PCR相比，定量PCR不仅实现了初始模板的绝对定量，而且其检测的灵敏度高（可检测到低拷贝的目的基因），可以区分微小的拷贝数差异，测定范围很广（10～1010拷贝）。

绝对定量的标准品可以是含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒、cDNA、或PCR产物。要求标准品的扩增序列与样本完全一致，制备的纯度要高，不应含有影响定量的因素，标准品和未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致。

2.相对定量 用于测定实验样本与对照样本中靶序列相对变化，是更普遍、简单的方法。在机体的细胞中，一些基因的表达量是恒定的，这些基因可以被用作内部参照（简称内参）基因，相对定量通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化实现定量。内参基因的要求：在细胞中的表达量恒定；受环境因素影响小；实验药品／处理对其影响可以忽略。一般使用内源性管家基因作为内参基因，如β-actin、GAPDH、rRNA等。

相对定量还需要对照样本（control）作为参照比较的基准。如摸索一系列药物浓度对细胞增殖的影响，需要一个0浓度的处理（只含有溶解药物的介质）作为对照样本，不同浓度处理与它对照。

（1）双标准曲线法：该法与绝对定量的标准曲线法相似。不同之处在于绝对定量中只用构建目的基因的标准曲线，且其标准品的量是已知的。而相对定量中需要同时构建目的基因和内参基因两条标准曲线，所用的标准品不用知道其准确拷贝数或浓度，只要知道相对稀释倍数即可。(https://www.daowen.com)

该方法第一步是制备标准品，包括内参基因和目的基因的标准品。标准品可以不知道准确拷贝数或浓度，但必须准确地进行倍比稀释，一般10倍、5倍、3倍都可以，并以最低浓度拟定假定拷贝数（一般为1），根据稀释比例类推出各个稀释浓度的拷贝数。第二步是分别将系列稀释的内参基因标准品和目的基因的标准品及待测不同实验组样品进行PCR，得出数据。第三步是制作标准曲线，得出方程及分析。一般荧光定量PCR仪软件会根据设置自动生成标准曲线，根据标准曲线给出实验样品和对照样品中内参基因和目的基因的相对拷贝数。用内参进行标准化处理，即用目的基因的拷贝数除以同一样本内参基因的拷贝数得出标准化的目的基因拷贝数；再将各实验组标准化的拷贝数除以对照样本标准化的拷贝数进行均一化处理，可得出实验样本相对于对照样本目的基因的表达倍数。假定目的基因在对照样本中表达量为1×，那么目的基因在实验样本中的表达量以相对于对照样本的n倍表示。当内参基因与目的基因扩增效率不一致或达不到100%±10%范围时，优先用该方法进行定量。

双标准曲线法的特点：①考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度地避免了误差。②思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无须像2-ΔΔCT法那样对条件进行反复的优化。③其不足之处是每次实验都必须对目的基因和内参基因做标准曲线。

（2）2-ΔΔCT法：该法运用数学公式来计算相对量。来自同一样品的目的基因和内参基因都要进行实时荧光定量PCR 反应，定量的结果用目的基因与内参基因CT 值之间的差值（ΔCT）来反映。在进行2-ΔΔCT法相对定量实验时，实验体系里必须包含实验样本和对照样本、目的基因和内参基因。ΔCT（目的基因）=CT（目的基因）-CT（同一样本的内参基因）；ΔΔCT（目的基因）=实验样本ΔCT（目的基因）-对照样本ΔCT（目的基因）的平均值；目的基因的相对倍数（实验样本／对照样本）=2-ΔΔCT（目的基因）。

2-ΔΔCT法的相对定量省去了构建标准曲线的麻烦。不足之处在于没有考虑PCR扩增效率对定量结果的影响，将PCR扩增效率设为100%。而实际扩增过程中，由于内参基因和目的基因的异源性，引物和体系需要优化，才能接近这个假设。

2-ΔΔCT法的特点：①使用该方法前提条件是目标基因和内参基因的扩增效率一致并且接近100%，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率一致，并在100%±10%范围内，可用该方法分析。在接下来的实验中，无须再做标准品。②该方法要求严格的重复，因为CT 值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。