分离与培养步骤

（1）取一只怀孕第12.5～14.5天母鼠（一般情况下每胎8～10只胚胎），CO2麻醉后脱颈处死，75%乙醇将体表消毒后，剪开腹部皮肤和肌肉，暴露出腹腔脏器，并将腹腔脏器移向膈肌方向以暴露出子宫，用镊子提起子宫颈一端，剪断周围粘连组织，将包含胎鼠的子宫移入准备好的PBS中。

（2）剥离出胎鼠，在PBS中充分清洗血渍。

（3）双手执直镊，左手执镊固定住胎鼠头部，右手执镊去除掉四肢、尾部、内脏和头部，将剩余躯干部分移入6 cm 皿中，6 cm 皿表面喷洒乙醇消毒后拿到细胞房生物安全柜中操作。

（4）将取到的躯干部分在PBS（每50 ml中加入1 ml P／S）中充分洗涤2～3遍后放到一个新的6 cm 皿中，用手术刀片将组织切的尽量碎，然后用弯镊将皿中切碎的组织转移至50 ml离心管中，再用PBS洗涤皿盖，将冲下的残留组织一并转入离心管。

（5）加入0.125%胰酶（1只胚胎躯干1 ml胰酶），37℃孵育10～15 min，每4～5 min用漩涡振荡器振荡1次，目的是使已经消化下来的细胞脱离组织，让消化液充分渗透到组织内部，促进消化。

（6）准备1支50 ml离心管，加入20 ml完全培养基，将消化好的细胞悬液用40μm 单细胞筛网过滤到含20 ml培养基的离心管中，滤成单个细胞。(https://www.daowen.com)

（7）将细胞进行离心，200 g离心4～5 min，室温进行。

（8）离心后弃除上清液，用新鲜培养基重悬后，进行细胞计数。计算总共得到多少细胞和每个胚胎平均细胞得率，并用台盼蓝染色计算因消化而导致的细胞死亡率。一般而言，如果消化充分的话，一个胚胎大约可以得到1 000万细胞；细胞的死亡率在10%～15%。

（9）细胞接种：一般而言，3个胚胎铺一个15 cm 培养皿，加入20 ml完全培养基；也可以每2个胚胎铺一个10 cm 培养皿，加入10 ml完全培养基。放入37℃、5%CO2培养箱中，十字交叉摇匀后，静置培养。

（10）培养24 h后，吸掉培养皿中含有死细胞的培养基（如有需要，可用PBS轻轻洗一遍），然后换成新鲜的完全培养基。

（11）一般而言，原代MEF细胞在3天左右即可完全长满，接下来就可以按照实验需要将细胞进行传代扩增（一经传代，就成为细胞系了）。