破骨细胞生物学研究方法
破骨细胞具有体积大且形态不规则、细胞内有多个细胞核、多个伪足和突起的形态学特征，也具有蚀骨等功能，故破骨细胞的生物学研究方法主要包括形态学和功能学两个部分。
1.形态学鉴定
（1）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色：TRAP是破骨细胞的重要标志性酶，广泛用于鉴定破骨细胞。骨髓中的单核-巨噬细胞是破骨细胞的前体，经过培养后分化为破骨细胞。常规方法为收集未贴壁的骨髓单核细胞，在含有M-CSF的培养液中过夜使其贴壁，贴壁的细胞即为破骨细胞前体细胞，该细胞再通过M-CSF／RANKL可以诱导破骨细胞的形成，通常培养形成破骨细胞需要的时间为5～6天。
染色步骤：破骨细胞培养完成后，去除培养基、PBS洗涤3次后，加入4%多聚甲醛室温固定10 min，随后加入TRAP染色液，确保能充分覆盖住样品，室温避光孵育30 min，可根据染色情况酌情增减染色时间（图18-3）。
图18-3 破骨细胞TRAP染色（×40）
（2）鬼笔环肽（Phalloidin）染色：成熟的破骨细胞在矿化基质上形成一个富含肌动蛋白（F-actin）的结构，即一种特异的细胞骨架，这种骨架允许破骨细胞在细胞与骨之间建立一种封闭的微环境，在该环境下可以通过质子转运的方式降解骨基质，对该特异性细胞骨架最常用的染色方式就是鬼笔环肽染色。
染色步骤：破骨细胞培养完成后，去除培养基、PBS洗涤3次后，加入4%多聚甲醛固定10 min，随后加入Rhodamine phalloidin染色液，确保能充分覆盖住样品，室温避光孵育30 min，可根据染色情况酌情增减染色时间，在对F-actin染色后通常再用DAPI复染破骨细胞细胞核（图18-4）。
图18-4 破骨细胞鬼笔环肽染色（×200）
（3）抗酒石酸酸性三磷腺苷酶（Tr ATP）染色：Tr ATP是破骨细胞发挥骨吸收功能的关键酶，与质子泵功能有关，也是鉴定破骨细胞的重要手段之一。(https://www.daowen.com)
染色步骤：破骨细胞培养完成后，去除培养基、PBS洗涤3次后，加入4%多聚甲醛固定10 min，随后加入由Tris-马来酸缓冲液、硫酸镁、硝酸铅及酒石酸钾钠配制的染色液，确保能充分覆盖住样品，室温避光孵育30 min，可根据染色情况酌情增减染色时间。
2.功能学鉴定
（1）RT-PCR检测：TRAP、cathepsin K（CtsK）、MMP-9、NFATc1等破骨细胞调控因子及标志性因子可以通过RT-PCR检测。
（2）骨吸收陷窝观察：骨质吸收是破骨细胞的重要特征，在象牙片或牛骨片上形成骨吸收陷窝是体外鉴定破骨细胞骨吸收功能的最可靠指标。骨吸收陷窝法操作步骤如下。
1）分离破骨细胞前体细胞进行培养直到破骨细胞刚刚开始形成。
2）采用硬组织切片，将牛股骨的骨片切成100μM 厚度，骨片用超声清洗3次，每次5 min，再用75%乙醇浸泡30 min消毒，随后在紫外灯下晾干。
3）牛骨片置于培养皿，刚刚形成的破骨细胞缓慢播种到牛骨片上，置37%培养箱培养24 h后，去除培养液，加入1 M 的氨水孵育30 min。
4）用超声波清洗骨片去除多余细胞，固定后，分别用2.5%谷醛和0.5% 苯甲酰胺蓝染色，室温孵育30 s，可根据染色情况酌情增减染色时间。
5）用蒸馏水清洗骨片，骨片晾干后压平，用二甲苯／树脂封片。
6）用电镜、光镜或者共聚焦显微镜观察到骨吸收陷窝，通常随机选择三个视野分析陷窝面积（图18-5）。