（一）实验原理

1.冻存的原因 ①由于遗传不稳定性而导致的基因突变；②细胞衰老，最后导致细胞系不稳定；③生长特性的转化，或获得恶性相关的表型；④由于选择和去分化导致细胞表型不稳定；⑤细菌、真菌、支原体等微生物污染；⑥细胞系之间的交叉污染；⑦操作粗心而导致细胞间的错误标记；⑧孵育箱故障；⑨保存那些暂时不需要进行实验的细胞系，节省时间和材料；⑩需要将细胞系转借给其他使用者。

2.冻存和复苏的理论基础 最佳的冻存条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤，以使细胞复苏时存活率最高。主要通过下述方法获得：①缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不能太慢，以避免冰晶形成；②用亲水性的低温保护剂排除水分；③在尽可能低的温度下保存细胞，降低高浓度盐对蛋白质变性的影响；④快速复苏，减少细胞内晶体形成。

3.冻存的原则 为确保实验结果的一致性和可重复性，除了严格传代操作外，另外一条重要的原则是对细胞进行双份冻存，原则是建立双份冷冻细胞库，一个主细胞库和一个工作细胞库（图5-6）。

当购买到或是初次从别的实验人员手里拿到所需细胞时，将细胞传代1～2次后少量冻存几支，这部分细胞为主细胞库（reserve stock）。从主细胞库中任意取出一支细胞复苏后传代扩增2～3代次（或在冻存主细胞时，取一部分消化下来的细胞进行传代扩增），然后再大批量地冻存数支细胞，这些细胞为工作细胞库（working stock）。(https://www.daowen.com)

图5-6　细胞的冻存和复苏使用原则

当需要进行相应实验时，从工作细胞库中取出一支细胞复苏，传代扩增1～2代后进行实验，整个实验在6～7代或1个月内结束，严禁一支细胞连续培养传代几个月以上。当完成实验或实验中途细胞发生污染等不可抗拒事件后，可以直接丢弃掉细胞；如需继续进行实验，则从工作细胞库中取出一支细胞复苏后再次进行。待工作细胞库使用完毕后，再从主细胞库中复苏一支细胞，传代扩增冻存一批工作细胞库。所有实验都使用工作细胞库中的细胞进行。