八、组织切片
不同的切片制备方法，其切片方法也有较大差别，组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡包埋半薄切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀仪器等。以下分别加以叙述。
(一)石蜡切片法
组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。为现在病理诊断常用的制作切片的方法。在切片前应先切去标本周围过多的石蜡(此过程称为修块)，但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切4～6μm的切片，特殊情况可切1～2μm。要观察病变的连续性，可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的组织便于长期保存。因此，石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用的一种方法。
1.切片前的准备
(1)固定后的标本经脱水、透明、浸蜡和包埋后，制成蜡块。高质量的蜡块和锋利的切片刀是保证切片质量的关键环节。检查切片刀是否锋利，简便的方法是用头发在刀锋上碰一下，如一碰即断，说明刀锋锋利。用显微镜观察可确定刀口是否平整，有无缺口。
(2)准备充足的经过处理的清洁载玻片和恒温烤片装置，大中号优质狼毫毛笔和铅笔(用于在载玻片的粗糙端写号)，如用普通载玻片，可用碳素墨水和蛋白甘油按3∶1体积混合后书写。
2.切片制作过程
(1)将预先修好的组织块先在冰箱中冷却，而后装在切片机固定装置上。将切片刀装在刀架上，刀刃与蜡块表面呈20°～30°角。将蜡块固定，调整蜡块与刀至合适位置，并移动刀架或蜡块固定装置，使蜡块与刀刃接触。
(2)切片多使用轮转式切片机，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，但小标本注意不要修得太多，以免无法切出满意的用于诊断的切片，标本应注意切全。切出蜡片后，用毛笔轻轻地托起，尔后用眼科镊夹起，正面向上放入展片箱(展片温度根据作用的石蜡熔点进行调整，一般低于蜡熔点10～12℃)，待切片展平后，即可进行分片和捞片。切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起放入展片箱更易展平。为减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热量，使石蜡保持合适的硬度，切片时可经常用冰块冷却切片刀和组织块，尤其在夏季高温季节更为必要。
(3)轮转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织，应将表皮部分向上;而胃肠等组织，应将浆膜面朝上)。
(4)捞片时注意位置，要留出贴标签的空间，并注意整齐美观。捞起切片后，立即编号。
(5)切片捞起后，在空气中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱内烤30分钟即可，也可用烤片器烤片。血凝块和皮肤组织应及时烤片。但对脑组织待完全晾干后，才能进行烤片。否则，可能产生气泡影响染色。
3.注意事项
(1)组织的取材和固定:取材时，组织块的大小厚薄应适当，过大、过厚的组织，固定液不易渗透，易引起固定不良。过小、过薄的组织，在固定和脱水的过程中易变硬或产生弯曲扭转，同样影响切片质量。陈旧、腐败和干枯的组织不宜制作切片。用陈腐组织制成的切片，往往核浆共染，染色模糊，组织结构不清，无法进行观察。固定不及时和固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅，轮廓不清，出现不同程度的片状发白区。组织固定时，固定液的量应充足，至少要在4倍以上，同时注意组织块不要与容器粘连。至于组织固定的时间，根据具体情况加以掌握。有关固定时应注意的事项，可参见有关章节。
(2)组织脱水、透明和浸蜡:组织脱水用的各级乙醇，应保证相应浓度，以便组织脱水彻底。但无水乙醇中，组织块放置时间不宜过长，否则组织过硬，切片困难。遇到此情况，可将组织浸在香柏油中软化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蜡和包埋。脱水乙醇，尤其是无水乙醇中混有水分，则组织脱水不干净。经二甲苯时，组织也无法透明，呈现混浊。此时应将组织在新的乙醇中重新脱水。二甲苯透明也应充分，否则不利于石蜡的浸透。但组织在二甲苯内的时间应严格掌握，时间过长组织易碎，也无法切出好的切片;时间不足，则石蜡不易浸透。浸蜡的温度也不宜过高，时间长短也应加以控制。总之，组织脱水、透明和浸蜡对于切片质量都有一定影响，组织脱水、透明和浸蜡过度，组织块变硬变脆，因此对于小块组织或小动物标本应注意时间。但若时间不够，组织块硬化不够，也不利于切片和染色。因此，应注意各具体环节的操作，并注意保证各种试剂的质量。
(3)切片:切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致，切片刀有缺口时，易造成切片断裂破碎和不完整。骨组织切片时，用重型刀较好。全钢刀或单面钨刀也适合石蜡或火棉胶包埋的骨组织。
(4)切片刀和切片机:切片刀放置的倾角以20°～30°为好。倾角过大，切片上卷，不能连在一起;过小，则切片皱起。应注意维护切片机，防止因螺钉松动产生振动，切片时会造成切片厚薄不均。遇硬化过度的肝、脑、脾等组织时，应轻轻切削，防止由于振动产生空洞现象。
(5)特殊要求切片的制作:石蜡切片虽然有很多优点，但制片过程中要经过乙醇和二甲苯等有机溶剂处理，因此很易造成组织内抗原性的丧失，在免疫组织化学染色时影响结果的准确性。因而有人采用冷冻干燥包埋法，即将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空和低温条件下除去组织内的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的组织，而后在进行浸蜡、包埋和切片。此法可保存组织内的可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，减少抗原的丢失。用于免疫荧光标记、免疫酶标记和放射自显影。
(二)冰冻切片法
冰冻切片在组织学技术中应用广泛，对临床快速病理诊断尤其具有重要意义。另外，因冰冻切片制作时不经各级乙醇的脱水，二甲苯的透明等过程，因此，对脂肪和类脂的保存较好，在进行脂肪染色和神经组织髓鞘的染色常用。
冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。组织不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后进行切片。
1.恒冷箱切片 将组织块在恒冷箱的切片机上切片。恒冷箱切片机的种类较多，可根据实际情况加以选用。一般调节温度为－25℃左右。箱内温度下降后，打开观察窗，将组织固着器放置到速冻台上，先放少量OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)或羧甲基纤维素，待冻结后将组织块放上，并在其周围加适量包埋剂，将组织块包埋。组织冻结后，将组织固着器装到切片机上，调整组织的切面与刀刃平行并贴近刀刃，将厚度调至适当位置后，关闭观察窗。初步修出组织切面后，放下抗卷板，开始切片。切出切片用载玻片贴附后，进行吹干或固定。这种切片用于科研和教学的连续切片，效果较好。在切片前，应预先启动进行预冷，同时准备多个冷却台，用于多块组织切片。
2.半导体制冷冰冻切片法 组织块放置在半导体制冷台上，加少许蒸馏水，调好切片的厚度。接通循环流水后，再接通电源，而且在使用的全过程中流水不能中断，关闭电路后，才能停水。还应注意电源正负极不能接反，用整流电源控制温度。冰冻组织周围的水不宜过多，用手检查组织块的硬度，当可切成厚薄一致的切片时，即可切片。切片用毛笔搌平后，立即用载玻片贴附，待切片刚要融化时，即刻入固定液内固定1分钟。已固定的组织切片，收集于清水中。根据目的进行染色。暂时不染色的切片，用载玻片吸附。
3.甲醇制冷器 制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装置，其冷却速度较快，属开放式，做一般常规冰冻切片用。
4.二氧化碳冰冻法 将组织块用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，关闭二氧化碳，即可切片。组织冷冻过硬易碎，若冷冻不够，组织块硬度不足，切片呈粥糜状，无法成片，应用间歇冷却法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最适合，应迅速切片。
5.冰冻切片黏片法 冰冻切片黏片法基本同于石蜡切片的粘片，但烤片温度不宜超过40℃。烤干后立即取出，温度过高或时间过长切片易碎。烤干后用70%乙醇和自来水略洗后即可染色。