实训项目七 动物病理组织切片实训
【实训目的】了解组织切片制作的程序，准备材料、用具、仪器，病理切片样品的采集和处理方法，石蜡包埋技术，切片技术，染色方法等。
【实训器材】组织切片机、磨刀机、展片箱、烤片台、冰箱等组织切片所需设备，脱水、透明、包埋、染色等所需材料、用具和药品试剂。
【实训内容】
(一)取材
根据病理诊断的具体要求取自被检动物机体(外科手术切除组织、尸体剖检采取组织)。
(二)固定
采取的病理材料必须立即放入10%福尔马林固定液中。
(三)脱水
组织经固定后，尚含有大量水分，而水与透明剂苯、石蜡根本不相融合。必须先把组织中的水分除去。但脱水剂必须是与水在任何比率下均能混合的液体，脱水剂常兼有硬化组织的作用。最常用的脱水剂为乙醇、丙酮等。
1.乙醇 沸点78.4℃，为最常用的脱水剂。脱水能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相混合。最终结果表明，只要脱水环节处理好，都会得到好的切片。脱水的程序为60%→70%→80%→90%→95%→100%。各级乙醇2～4小时，视材料的大小、厚薄而定。100%乙醇有硬化组织的作用，时间不宜太长，一般不超过3小时。脑组织、脂肪组织或疏松结缔组织，脱水时间要适当延长。
2.丙酮 沸点为56℃。脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大，主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间l～3小时。
(四)透明
透明对组织有脱乙醇及透明两种作用。当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织呈现不同程度的透明状态，具有这种作用的试剂称为透明剂。常用的透明剂有:
1.二甲苯 二甲苯为最常用的良好透明剂，不影响各种染色。二甲苯易溶于乙醇，能溶解石蜡，也是封固剂，不吸收水，透明能力强，易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，特别对小动物组织材料必须严格控制好(各种器官的透明差异很大)，通常为0.5～1小时。
当二甲苯透明时必须持组织放在专用二甲苯皿器中，这样可减少透明时间，有利于组织透明彻底，在换组织块透明时候，所用的镊子等器具必须干燥，不得将水滴混入二甲苯中，因水滴易被组织吸收而影响透明程度，潮湿天气更应引起注意。
2.冬青油(水杨酸甲酯) 冬青油为无色油样液体，易溶于醇、醚及冰醋酸，难溶于水。透明速度较慢，数小时或数天。一般经无水乙醇脱水后再入冬青油。
(五)浸蜡(透蜡)
组织经脱水透明后要用石蜡等支持剂透入内部，并除去组织中的透明剂，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成切片。浸蜡的要点:一是石蜡要完全渗入细胞的每个部分;二是石蜡要紧密而均匀的贴在细胞内外两面，使组织与石蜡成为不可分离的状态。
为了减少组织的收缩和提高浸蜡的效果，浸蜡用的石蜡依据熔点不同，先经低熔点石蜡再经高熔点石蜡。一般设置熔点50～52℃为第一缸蜡，52～54℃为第二缸蜡，54～56℃为第三缸蜡，第三缸石蜡的熔点根据季节可进行调节，夏天使用熔点56～58℃或58～60℃石蜡，盛夏使用熔点60～62℃石蜡。
浸蜡的时间 根据不同组织类型及其大小而定:组织1～2cm大小，浸蜡2～3小时，2～3cm浸蜡3～5h，对细胞密集，纤维成分少，如肝、肾应减少时间，含脂肪和纤维成分较多的组织需增加时间。浸蜡时石蜡在温箱内的温度应与石蜡的熔点相配合，温度不可过高或过低，过高会使组织高度收缩变脆，无法切片，过低石蜡将凝固达不到浸蜡的作用。常规的作法是调节至略高于石蜡熔点2～3℃。控制温度是浸蜡极其重要的关键。
(六)包埋
将液态的石蜡倒入金属包埋框或包埋的纸盒中，再将浸好蜡的组织块平放底部，注意切面方向朝下放置，待石蜡凝固后去掉包埋框，完全冷却变硬后再修整蜡块，要求组织外围的石蜡保留适中以便切片。
(七)切片前的准备工作
1.修整蜡块 石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介。应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡边。留得过少，使连续切片分片困难且易破坏组织;留得过多，徒占地方，同时使标本之间的距离过远而镜检不便。蜡块两边必须切成平行的直线，否则切下的蜡条弯曲，也不可修成圆角，致蜡带容易分开，不能成条。
2.玻片处理 一般玻片用76mm×26mm载片，厚度1～1.5mm，厚于1.5mm的玻片不宜用于高倍镜及油镜的观察，选购玻片应注意:从侧面看白色的为优品，带蓝或绿色的为劣品，平面光滑不带波纹者为上品，稍有波纹者为次品;边缘光滑已加工磨边者为上品，边缘粗糙未经磨边者为次品。载玻片上面如有云雾斑点，系受霉菌侵蚀不能使用。
新的玻片也必须擦洗干净，否则染色时引起切片脱落，方法有煮沸洗涤法、洗液浸泡法。最后经95%乙醇浸泡脱脂、烘干。
将洗净的载玻片上均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油(防止组织脱片)，放置冰箱备用。
(八)切片制作过程
1.将预冷的蜡块固定在石蜡切片机上，使蜡块的切面与刀口成平行方向，刀的倾斜度通常为15，转动轮转推进器，调节切片厚度为6μm，切成厚度均匀的切片。
2.左手持毛笔，右手旋动切片机转把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻镊蜡片，以正面放入展片箱中，其水温保持在40～43℃，待其展平后捞片。
3.贴附切片。左手持载玻片之一端，垂直入水将切片贴附于玻片上的2/3处。
4.切片贴附后，放在空气中稍晾干，即可进行烤片。血块组织、皮肤组织须及时烤片。但对脑组织、脂肪组织待完全晾干后才能进行，这样可防止产生气泡而影响染色。烤片的温度以蜡熔化为准，也可以放置相近温度的烘箱内烘烤过夜。
(九)染色与封片
将上述贴好的组织蜡片经二甲苯脱蜡后，再用乙醇由高浓度到低浓度脱苯。先用苏木精染细胞核，用自来水洗去切片上的染液，再用1%盐酸乙醇分色后用流水充分洗去余酸。最后用伊红液染细胞质。再用乙醇脱水、二甲苯透明，在切片标本上滴加树脂，再加盖玻片封固。
(十)实验注意事项
1.固定组织所用的固定液要充足，至少相当于标本总体积的5倍以上，标本容器及其口径大小适当，使标本能原形进行固定，避免使标本遭受挤压。
2.组织块透明在制片中是很重要的环节，如果组织不能透明，其原因可能有脱水未尽、组织太厚、透明时间不够以及与某些组织本身性质有关等。所以应从多方面考虑，尽可能使组织达到透明目的。通常根据透明时间与眼观相结合判断透明程度。
3.凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制成好切片。
4.固定失时或固定不当的组织，染色时常出现核染色质着色浅、轮廓不清，出现程度不等的片状发白区。
5.组织脱水、透明和浸蜡过度，会造成组织过硬过脆，特别是小动物组织应严格控制。
6.切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起，不能顺利连成长蜡带。切片刀有缺口，易造成切片断裂、破碎、不完整及刀痕等现象，不利于切片和观察。
7.组织切片机各个零件和螺钉应旋紧，切片刀应固定牢固，否则将会产生振动，以致出现切片厚薄不匀和横皱纹等现象。
【实训考核】
1.每人切出2～3张石蜡切片。
2.完成所切切片的H.E染色过程。