激素受体的检测
Beatson于1896年报道了，将双侧卵巢切除，可使晚期转移性乳腺癌患者症状得到一定的缓解，从而使乳腺癌与卵巢内分泌功能之间的密切关系得到首次报道。随后，在1965年，Toft等通过实验研究首次在体外发现大白鼠子宫内存在着特异性吸附雌激素的物质，当时人们将其称为雌激素受体(estrogen receptor，ER)。1967年Jensen等通过研究发现在乳腺癌的癌细胞胞浆内发现有雌激素受体。在接下来的一段时间内，科研工作者们又相继发现了孕激素受体(progesterone receptor，PR)。众所周知，乳腺是雌激素和孕激素的靶器官，研究发现，不管是雌激素、还是孕激素，它们能在靶器官发挥其相应的生物学效应是通过其相应的受体来实现的。乳腺对激素反应的大小是由乳腺上皮细胞内受体的含量决定的，但是细胞对激素产生效应的关键是激素-受体复合物与细胞核的相互作用决定的。研究发现，在正常乳腺上皮细胞中既存在ER和PR，但是当细胞发生癌变时，ER和PR可以部分或全部丢失，也可以部分或全部保留。那么依据受体情况的有无，如果癌细胞仍保留受体，那表明该乳腺癌患者中的细胞生长和增殖仍然受到激素的调控，临床上将这种乳腺癌称为激素依赖性乳腺癌，这类型占全部乳腺癌的50%～70%。反之，如果癌细胞在生长和增殖时丢失了受体，那么该类型的乳腺癌的生长和增殖并不再受内分泌调控，这种类型的乳腺癌被称为非激素依赖性乳腺癌。近40年来ER、PR的检测及其应用就成为乳腺癌研究的热点之一。
ER和PR不仅是乳腺癌患者的重要预后指标，也是指导患者接受内分泌治疗的依据。因此，如何检测和判断ER、PR表达情况，对乳腺癌患者的预后判断和治疗选择至关重要。
美国病理学家学会(College of American Pathologists，CAP)和美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)于2010年发布了最新的关于乳腺癌ER、PR免疫组化检测指南，分别是以下7方面。
(一)ER、PR的检测方法
1.生物化学检测法
这种方法是检测ER、PR最早的方法，建立于20世纪60年代中期，而且也是目前公认的检测受体的经典和可靠的方法。这种方法需要用新鲜肿瘤组织标本，并且以经冷冻、粉碎及超速离心制成细胞质成分的抽提液，作为待测标本。该方法的试剂主要为氟标记的雌二醇或孕酣。研究发现，一旦与标本作用后，性激素就与胞质中的未与性激素结合的游离“受体”结合，形成性激素-受体复合物。而后分离有同位素标记的与受体结合的及无同位素标记的与受体结合的性激素，可计算出性激素游离受体的含量。常用的分离方法一般采用葡聚糖包裹活性炭(dextran coated charcoal，DCC)法来吸附带有同位素标记的受体，然后再用液闪法测定与受体结合的带有同位素标记激素的含量。这种方法从根本上讲，是用性激素探测受体(实为其游离部分)。这是一种亲和作用，因为标本为胞质，当时认为受体位于胞浆内，其含量以fmol/mg蛋白表示。并根据受体含量水平，划分为ER、PR阴性(＜10 fmol/mg蛋白)或阳性(＞10fmol/mg蛋白)。该法能对受体做精确的定量测定，但不能做形态学定位。
2.荧光或酶标亲和法
20世纪70年代末和80年代初，建立了荧光或酶标亲和法，这种方法的原理是利用激素与其相应受体高亲和性和特异性结合的特性，以荧光或酶标记激素检测受体的存在及定位。实验所用的雌激素或孕激素为荧光素或辣根过氧化物酶标记，检测标本为新鲜肿瘤组织的冰冻切片，它是用性激素来探测肿瘤组织中的呈游离状态的受体。该法所测的受体部位主要位于细胞的胞浆内，以阳性细胞数及其阳性荧光或染色强度表示，可作半定量检测和形态学定位。1989—1996年天津肿瘤医院乳腺癌研究室应用酶标亲和法检测乳腺癌ER和PR共4210例，其阳性率分别为62.9%及46.9%，与DCC法相对照，符合率达80%。
3.免疫化学亲和法
20世纪80年代初，研究者们建立了一种新的检测方法，即免疫化学亲和法，它的原理是先将孕酮或雌二醇与需要检测的组织切片进行共孵育，使它们在体外完成与切片组织内的受体相结合，在此基础上，进行相应的洗涤步骤，然后再加入相应的抗体，如抗雌激素抗体或抗孕激素抗体，然后进行检测，经DAB显色后镜下观察。这种方法是以性激素抗体检测性激素的一类方法，它属于免疫反应，相反，如果以性激素探测其受体则属于亲和反应。该法检测的是受体的总量，它包括游离的和已与性激素结合的受体，主要位于胞浆内，可作形态学定位和半定量检测。由于用石蜡标本检测，故可进行回顾性研究。
4.免疫组织化学法
ER、PR的单克隆抗体于20世纪80年代问世，它们的发现为直接检测受体创造了条件，在此之后相继建立了很多种检测受体的免疫组化法，这些免疫组化的共同点是均以ER、PR的单抗为一抗，然后再以不同方法加上显色系统，这一系列的检测方法都可作形态学定位和半定量检测ER和PR。这种方法与前述各种间接检测受体的方法不同，其优点是用ER、PR抗体直接检测ER、PR。其显示的受体部位主要在胞核内，检测的是受体蛋白的总量。但是在这种方法发现的初期，由于它只能用于新鲜冰冻切片检测，在推广方面有一定的局限性，但是近年来由于免疫组化抗原修复技术的迅速发展，这种检测方法已广泛应用于石蜡切片标本的检测。
依托ER、PR单克隆抗体所建立起来的免疫组织化学检测法，一直受到人们的推崇。欧洲8个实验室于1986年分别对同一批乳腺癌患者的癌组织进行了ER免疫组织化学检测法及DCC法的检测，并且在同年报道了他们的最终研究结果，他们的研究结果显示两种检测方法在检测结果上并无显著性差异；在此期间的临床观察也表明，免疫组织化学检测法的检测结果与临床内分泌治疗疗效有很好的相关性。免疫组织化学检测法的优点在于它所检测的ER、PR定位清晰，结果可靠，重复性好，已是目前国际上检测ER、PR的通用方法。
利用免疫组织化学检测法检测激素受体的两个关键点是：①选择高稳定性的、高质量的ER、PR单克隆抗体；②免疫组化抗原修复：即石蜡切片在进行免疫组织化学染色前必须进行有效的抗原修复，使切片在处理过程中被遮蔽的抗原重新得到暴露。
采用LSAB免疫组化法检测ER、PR可分为如下几个步骤进行：
(1)将制备的载玻片浸入2%APES丙酮溶液30s，随后转到纯丙酮中过一下，紧接着将切片取出，然后放在通风处晾干备用。
(2)切片厚度的处理，对于乳腺癌组织石蜡切片，其厚度约为4μm，然后脱蜡。
(3)将切片置于3% H2O2室温孵育10 min，这一步的作用在于阻断内源性过氧化物酶的催化作用。
(4)配置TBS缓冲液，TBS洗2 min×3次。
(5)加入0.4%胃蛋白酶消化，37℃消化10 min；然后TBS洗2 min×3次。
(6)抗原组织修复切片，将其浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，微波炉95～98℃，煮沸10 min；然后再放在室温冷却10～30 min，最后用TBS洗2 min×3次。
(7)结束后，向切片中加入10%血清进行封闭，然后室温放置20 min。
(8)滴加雌激素或者孕激素单克隆抗体(即一抗)于切片上，37℃，60 min或4℃冰箱过夜。
(9)TBS漂洗，2 min×3次。
(10)滴加生物素标记的二抗，37℃，30 min。
(11)TBS漂洗，2 min×3次。
(12)滴加辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，37℃，30 min。
(13)TBS漂洗，2 min×3次。
(14)DAB显色，首先用自来水冲洗，然后滴加苏木素进行复染，最后再以中性树胶封片。
(二)临床应用
1.用于评估乳腺癌患者的预后
众所周知，肿瘤细胞的分化包括形态和功能两方面，研究发现雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)二者是具有特定生理功能的蛋白质，从分化程度来看，那些高分化的肿瘤细胞其功能较全面，反之细胞分化差，则其功能亦差。这就为乳腺癌患者的预后提供了理论依据，ER与PR阳性者预后较好，而阴性者预后较差。大量的临床研究资料均证实，在预后方面，ER、PR阳性的乳腺癌患者的预后较好，这种情况下的缓解率高，手术后复发情况少。在伴有转移的乳腺癌病例中，受体阴性的乳腺癌患者以肝、肺等内脏转移多见；而受体阳性乳腺癌患者，其转移部位多在皮肤、软组织或骨髓。另有研究发现，在乳腺癌患者的短期随访中，统计数据显示，ER、PR均与预后有关，但是当延长随访期时，研究发现则只有PR与预后有关。因此，在检测ER的同时检测PR则更有参考价值。
2.选择内分泌治疗的重要指标
研究发现，内分泌治疗只对激素依赖性乳腺癌患者有效，而对非激素依赖性乳腺癌是无效的。国内外众多报告也证实，未经受体测定的乳腺癌病例盲目行内分泌治疗的有效率约为30%，ER阳性病例内分泌治疗的有效率为50%～60%，ER及PR二者均阳性病例内分泌治疗的有效率高达77%～80%，而ER及PR二者均阴性的患者的有效率仅为8%～10%。基于前述的相关研究在检测ER的同时检测PR，对选择内分泌治疗更有意义。由于受体含量高的乳腺癌对内分泌治疗的有效率高，因此，仅测出受体阳性或阴性的结果还不够，还应该同时测定其量或阳性细胞的百分数，以便为临床选择内分泌治疗提供更可靠的依据。因为受体状况对评估乳腺癌患者预后和选择内分泌治疗具有重要意义。
(三)ER、PR免疫组化检测结果的最佳判断标准
(1)ER、PR阳性定义：≥1%的肿瘤细胞核着色。
(2)ER、PR阴性定义：在有阳性内对照的情况下，＜1%的肿瘤细胞核着色。
(3)ER、PR不确定定义：同一标本中正常腺上皮细胞核着色而肿瘤细胞核均不着色，或同一标本多次送检均未发现肿瘤细胞核着色。
以上定义基于下列实验室相关管理规定：ER、PR阳性及阴性的初始分类与最终临床分类结果的一致率分别达到90%和95%，内部质量控制应包括每种方法中ER、PR反应性的外对照及常规方法的再次评估、技术人员和病理诊断人员的资质认证；依据技能考核规定参加外部技能测试；每两年由评审机构进行评审。
(四)最佳检测条件
(1)在保证切除组织能够代表组织学分级和病理类型的基础上尽量采用大块、多部位取材的标本。
如出现下列情况时应该重新检测：外部对照不可靠(每日评分记录存在差异)；同一切片上没有正常阳性对照；标本经强酸处理过；标本呈现ER阴性/PR阳性表型；标本处理时间过长或者鉴定时间＜6小时或＞72小时：在缺少内部阳性对照的情况下，标本检测结果呈阴性。
(2)根据指南进行以下注解：ER、PR为≥1%的肿瘤细胞核着色，同时报告应包括平均染色强度和范围；需进行图像分析，因其有利于分析染色范围；应提供H评分、Allred评分或Quick评分结果；＜1 %的肿瘤细胞ER、PR染色阳性时为ER、PR阴性；结果解读应有条理性，以保证正式报告的一致性和说服力。
切片记录纸或正式报告应包括指南相关的条目，以及(留)最佳标本处理条件。
(3)从获取标本组织到标本固定的时间间隔应尽可能短。ER、PR检测标本应该用10%中性甲醛固定6～72小时；对标本行适当的大体检查并确定切缘后切成5mm厚，然后置于足量的固定液中，使标本得到充分浸泡；若标本来自外地，则应将肿瘤组织切成双份，并保存在10%中性甲醛液中送实验室检测；处理时间、标本固定类型和甲醛处理时间均需做记录。(https://www.daowen.com)
(4)不建议对保存时间超过6周的标本进行检测。
(5)从患者身体切取标本的时间、标本固定开始时间、整个固定时间以及固定类型，均需记录并备注在切片记录纸或正式报告中。
(五)最佳内对照程序
(1)任何检测手段的认证都应在正式实施检测前确定。
(2)必须使用经临床证实的ER、PR检测方法进行验证检测。
(3)一旦检测体系发生明显变化，应进行再次认证。如一抗的改变、新的抗原修复或检测系统的引入。
(六)最佳内部质量保证程序
(1)首次检测验证。
(2)后续质量控制和设备维护。
(3)首次及后续的实验室人员技能培训和资格认证。
(4)采用标准化操作程序，包括对每一批检测样品均使用外对照材料，常规评估内对照即正常腺上皮。如条件允许，每张检测切片均应包括正常乳腺组织。
(5)至少每半年进行常规的质量评估。一旦检测体系发生明显变化，应进行再次认证。
(6)持续的资格评估及培训。
(七)最佳外部质控评估
(1)实验室每年必须参加至少两次外部质控评估测试。
(2)实验室操作人员在任意一次检测中正确率均达到90%以上方为合格。若测试不合格，则实验室应依据鉴定委员会相关要求作出解释。
(八)最佳实验室资质鉴定
每年进行自我检查和隔年进行现场检查，评估实验室资质认证结果、标本处理流程、质量控制情况及病理报告。考核不合格的实验室应停止检测ER、PR。
(九)可手术乳腺癌的辅助治疗原则与策略
1.HER2过表达伴激素反应性(PR阳性和(或)ER阳性)乳腺癌的辅助治疗
HER2过表达指CISH或FISH检测阳性，或IHC检测HER2(+++)，免疫组化检测HER2(++)的患者，最终结果应由CISH或FISH证实。我们按照肿瘤的实际大小又分为如下几种情况，制定相应的治疗原则：
(1)肿瘤直径为0.6～1.0cm，且病理分期为高分化浸润性癌，这种情况临床一般不考虑辅助治疗，但是当病理结果显示有淋巴结微小转移时(0.2mm＜直径＜2.0mm)，可考虑进行内分泌治疗。
(2)肿瘤直径为0.6～1.0cm，且病理分期为中/低分化浸润性癌或高核分级、高组织学分级、有血管淋巴侵犯等不良预后因素的患者，临床上应给予辅助内分泌治疗加辅助化疗。
(3)肿瘤直径＞1.0cm时，不管分期如何，可进行如下治疗：即内分泌治疗+辅助化疗+曲妥珠单抗。
(4)当淋巴结阳性时，即1个或多个同侧腋窝淋巴结阳性且伴有有1个或多个＞2mm的转移灶，不管分期如何，可进行如下治疗：内分泌治疗+辅助化疗+曲妥珠单抗。
有研究结果证实，处于绝经前，且激素受体阳性乳腺癌患者，利用放疗或手术进行卵巢切除的获益与单用CMF方案相同；另有研究报道显示，利用卵巢抑制原理(如LHRH拮抗剂或激动剂)所获得的益处与卵巢切除相同。这些研究给我们的提示：卵巢抑制/切除联合内分泌治疗其效果可能优于单用卵巢抑制/切除。但是在那些已经接受过辅助化疗的绝经前患者中，卵巢抑制/切除的益处目前尚不确定。在临床上以化疗和内分泌治疗进行辅助治疗时，医务工作者们应该按照先化学辅助治疗再内分泌辅助治疗的顺序进行，这种治疗方式可以使化学辅助治疗和内分泌辅助治疗给患者带来的获益相互叠加，单纯由化学辅助治疗带来的获益可能很小，所以对于是否在内分泌基础上加用化疗应个体化考虑，尤其是对于那些预后较好以及年龄在60岁以上的患者，因为就她们的个体而言，对她们加用化疗的使其获得的益处将更小。目前已有的研究表明，采用序贯或者同时应用内分泌辅助治疗和放疗都是可行的。目前尚无足够的研究资料支持70岁以上的患者接受化疗。总而言之，选择何种治疗应根据患者的情况进行个体化治疗。
2.HER2低表达伴激素反应性(PR阳性和/或ER阳性)乳腺癌的辅助治疗
HER2低表达指CISH或FISH检测阴性，或IHC检测HER2(-)～(+)。
(1)肿瘤直径为0.6～1.0cm，且病理分期为高分化浸润性癌，这种情况临床一般不考虑辅助治疗，但是当病理结果显示有淋巴结微小转移时(0.2mm＜直径＜2.0mm)，可考虑进行内分泌治疗。
(2)肿瘤直径为0.6～1.0cm，且病理分期为中/低分化浸润性癌或高核分级、高组织学分级、有血管淋巴侵犯等不良预后因素的患者，临床上应给予辅助内分泌治疗加辅助化疗。
(3)肿瘤直径＞1.0cm时，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助内分泌治疗+辅助化疗。
(4)当淋巴结阳性时，即指l个或多个同侧腋窝淋巴结阳性且伴有有1个或多个＞2mm的转移灶，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助内分泌治疗+辅助化疗。
3.HER2过表达伴激素无反应性(PR和ER阴性)乳腺癌的辅助治疗
(1)肿瘤直径≪0.5cm时，或病理分期显示为微浸润的浸润性乳腺癌：这种情况临床一般不考虑辅助治疗，但是当病理结果显示有淋巴结微小转移时(0.2mm＜直径＜2.0mm)，则可考虑进行辅助化疗。
(2)肿瘤直径为0.6～1.0cm的患者，应首先考虑辅助化疗。
(3)肿瘤直径＞1.0cm时，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助化疗+曲妥珠单抗。
(4)当淋巴结阳性时，即1个或多个同侧腋窝淋巴结阳性且伴有有1个或多个＞2mm的转移灶，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助化疗+曲妥珠单抗。
4.HER2低表达伴激素无反应性(PR和ER阴性)乳腺癌的辅助治疗
(1)肿瘤直径≪0.5cm时，或病理分期显示为微浸润的浸润性乳腺癌：这种情况临床一般不考虑辅助治疗，但是当病理结果显示有淋巴结微小转移时(0.2mm＜直径＜2.0mm)，则可考虑进行辅助化疗。
(2)肿瘤直径为0.6～1.0cm的患者，应首先考虑辅助化疗。
(3)肿瘤直径＞1.0cm时，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助化疗。
(4)当淋巴结阳性时，即1个或多个同侧腋窝淋巴结阳性且伴有有1个或多个＞2mm的转移灶，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助化疗。
5.组织学类型显示良好(如黏液癌、管状癌)的乳腺癌全身辅助治疗
(1)PR和(或)ER阳性：对pNO或pNlmi(腋窝淋巴结转移灶直径≪2mm)、pT1、pT2或pT3的患者，假如肿瘤的直径＜lcm，临床上不建议进行辅助治疗；肿瘤直径处于1～2.9cm，临床上考虑辅助内分泌治疗和(或)辅助化疗；当肿瘤直径≫3cm时，临床上选择辅助内分泌治疗+辅助化疗。当淋巴结阳性时，即1个或多个同侧腋窝淋巴结阳性且伴有有1个或多个＞2mm的转移灶，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助内分泌治疗+辅助化疗。
(2)ER和PR阴性：对pNO或pNlmi(腋窝淋巴结转移灶直径≪2mm)、pT1、pT2或pT3的患者，假如肿瘤的直径＜lcm，临床上不建议进行辅助治疗；肿瘤直径处于1～2.9cm，临床上考虑辅助化疗；当肿瘤直径≫3cm时，或当淋巴结阳性时，即1个或多个同侧腋窝淋巴结阳性且伴有1个或多个＞2mm的转移灶，不管分期如何，可进行如下治疗：辅助化疗。