2.1.1　限制性核酸内切酶的发现与种类

2.1.1　限制性核酸内切酶的发现与种类

核酸酶是通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致多核苷酸链发生断裂的一类水解酶。根据其作用底物不同，可分为特异水解断裂DNA分子的脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）和专门水解断裂RNA分子的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）。按水解断裂分子的方式不同，又可分为以下两类：一类是从核酸分子末端开始逐个消化降解多核苷酸链，称为核酸外切酶（exonuclease）；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段，称为核酸内切酶（endonuclease）。

1.限制性核酸内切酶的发现

限制性核酸内切酶，又称限制性内切酶或限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。那么其中的“限制性”究竟意味着什么呢？

早在20世纪50年代初期，许多学者就发现这样的一个现象：X型菌株能够辨别在该菌株生长的和在别的Y型菌株生长的噬菌体，而且还能阻止在后者生长的噬菌体对其的感染。为了便于叙述，将在X型菌株上生长的噬菌体用Px表示。其中以λ噬菌体表现的现象最具有代表性和普遍性。那些在大肠杆菌B菌株（Escherichia coli B，E.coli B）中生长得很好的λ噬菌体（λ（B））在K菌株（E.coli K）中生长时，其感染频率（efficiency of plate，EOP）由1下降到10-4，也就是说，λ（B）噬菌体受到K菌株的限制（restriction）。一旦λ（B）噬菌体在K菌株中感染成功，由K菌株繁殖出来的噬菌体后代在第二轮接种中便能像λ（K）噬菌体一样高效感染K菌株，而没有再次受到限制，这种现象称为修饰（modification）。但它不再高频感染它原来的宿主B菌株。无论是限制还是修饰，两者都是由宿主控制的，将其统称为宿主控制的限制和修饰现象（host controlled restriction and modification，R-M）（图2-1）。

10年后，终于弄清了细菌限制和修饰作用的分子机制。在细菌细胞内同时存在两种酶，即限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶，两者共同构成细菌的限制-修饰系统。限制性核酸内切酶是一种位点特异性核酸酶，它能识别DNA分子上的特定位点并将DNA双链切断；修饰性甲基化酶能催化甲基从其给体分子S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之发生甲基化，由于限制性核酸内切酶无法识别甲基化的序列，因而不能再进行切割。λ（K）和λ（B）长期寄生在大肠杆菌的K菌株和B菌株，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，因而避免了限制性核酸内切酶对宿主本身DNA和噬菌体DNA的破坏。当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性核酸内切酶的特异性降解。在降解过程中，总有极少数入侵的DNA分子幸免于难而得以在宿主甲基化酶存在的条件下复制，并在复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌株，但丧失其在原来宿主细胞中的存活力，因它们在接受新宿主菌甲基化修饰的同时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。

宿主控制的限制和修饰现象是广泛存在的，它的存在有两方面的作用：一是对外源DNA进行限制性降解；二是对自身DNA进行限制性修饰而不被降解。也就是说，限制-修饰系统既对外源DNA进行限制，构筑了细菌种属和菌株之间进行交叉繁殖的屏障，又允许外源DNA中有一些通过，这又有利于生物的进化。正是这些限制性核酸内切酶的发现使得基因工程成为可能，这是跨时代的突破。在基因工程中，我们需要采用缺少限制作用的菌株作为受体，以保证基因操作的顺利进行。

2.限制性核酸内切酶的种类

目前所发现的限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。三类限制性核酸内切酶的主要特征见表2-1。

1）Ⅰ型限制性核酸内切酶

1968年，M.Meselson和R.Yuan从E.coli K菌株中分离得到的第一种限制性核酸内切酶EcoK，就是一种Ⅰ型限制性核酸内切酶。Ⅰ型酶只占1％。

Ⅰ型酶是一种复合功能酶，既具有核酸内切酶的活性，又具有甲基化酶的活性，即同时具有限制和修饰功能，需要Mg2+、ATP、SAM作为催化反应的辅助因子。Ⅰ型酶是大型的多亚基的蛋白质复合物。例如，EcoK和EcoBⅠ型酶，都是异源多聚体，它们均由三种不同的亚基组成，其中特异性亚基（S亚基）具有特异性识别DNA序列的活性，修饰亚基（M亚基）具有甲基化酶的活性，限制亚基（R亚基）具有核酸内切酶的活性。它们分别由hsdS、hsdR、hsdM基因编码，属于同一操纵子。EcoK的结构为R2 M2 S，EcoB的结构为R2 M4 S2。

Ⅰ型酶能识别专一的核苷酸序列，长度为十几个核苷酸，在距识别位点5'一侧数千碱基处随机切割DNA分子。Ⅰ型酶甲基化作用可以在DNA两条链上同时进行，甲基的供体是S-腺苷甲硫氨酸。例如EcoB酶的识别位点是TGA*N8TGCT（N表示任意碱基），甲基化位点是第3个A碱基，在距识别序列1000 bp处进行切割。

Ⅰ型酶只特定地识别DNA序列，而切割位点不特异，因而在基因工程中用处不大。

2）Ⅲ型限制性核酸内切酶

现在知道的Ⅲ型限制性核酸内切酶的种类更少，所占比例不到1％。Ⅲ型酶是由2个亚基组成的蛋白质复合物，具有核酸内切酶和甲基化酶活性，其中M亚基负责位点的识别和修饰，R亚基则具有核酸酶活性。Ⅲ型酶在与识别位点结合后，其修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。酶的切割活性需要Mg2+、ATP、SAM等辅助因子，切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，不同的Ⅲ型酶具有各自不同的距离，7～26 bp不等。如Mbo Ⅱ识别序列是5'AAGA3'，其切割位点则是：

5'-GAAGANNNNNNNN ↓ N-3'
3'-CTTCTNNNNNNN ↓ NN-5'

产生仅一个碱基的突出末端，具有不确定性。

Ⅲ型酶虽然有专一的识别序列，但切割无特异性，切割后产生的DNA片段具有各种单链末端，因而在基因克隆中很少使用。

3）Ⅱ型限制性核酸内切酶

1970年，H.O.Smith等首先从流感嗜血菌Rd菌株分离出Ⅱ型限制性核酸内切酶。Ⅱ型酶所占比例最大，可达93％。Ⅱ型酶需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。Ⅱ型酶不但能特异性识别DNA序列，而且在特定位点切割，识别和切割位点的特异性使其成为重组DNA技术中最常用的工具酶，并被誉为“分子手术刀”。如果没有专门说明，通常所说的限制性核酸内切酶指的就是Ⅱ型酶。