6.3.4　免疫化学检测法

6.3.4　免疫化学检测法

直接的免疫化学检测技术同菌落杂交技术在程序上是十分类似的。但它不是使用放射性同位素标记的核酸做探针，而是用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要一个克隆的目的基因能够在大肠杆菌宿主细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。现在已经发展出一套特异地适用于这种检测法的载体系统，它们都是专门设计的“表达”载体，因此，由它们所携带的外源基因能够在大肠杆菌宿主细胞中进行转录和翻译。

免疫化学检测法一般可分为两类，即抗体测定法（antibody test）和免疫沉淀测定法（immunoprecipitation test）。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为宿主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。

1.抗体测定法

常用的抗体测定法包括放射性抗体测定法和非放射性抗体测定法等。

1）放射性抗体测定法

1978年，S.Broome和W.Gilbert设计了一种免疫学筛选方法，现已发展成为常规的放射性抗体测定法之一，其基本依据有三：①一种免疫血清中含有多种类型的免疫球蛋白IgG分子，这些IgG分子分别与同一抗原分子上不同的抗原决定簇特异性结合；②抗体分子或其某部分可牢固地吸附在固体支持物（如聚乙烯塑料制品）的表面上，因此不会被洗脱掉；③经过体外碘化作用，IgG抗体会迅速地被放射性125I标记上。

在Broome和Gilbert所使用的放射性抗体测定技术中，抗体是同作为固体支持物的聚乙烯薄膜相结合。他们同样也是使用免疫珠蛋白片段，但是用125I放射性同位素进行标记，作为第二种抗体来检测固定在聚乙烯薄膜上的与抗体相结合的抗原。图6-10中（a）和（b）为涂有胰岛素抗体的塑料盘，同培养皿中的菌落进行表面接触；（c）为分泌胰岛素的菌落所含的抗原分子（胰岛素）同抗体结合；（d）为塑料盘随后移放在放射性标记的抗胰岛素抗体的溶液中；（e）为放射性抗体黏着到塑料盘中相应于分泌胰岛素的菌落印迹位置上。在讨论放射性抗体测定法的同时，还有必要简单地叙述一下由Broome和Gilbert发展的双位点检测法（two sites detection method）。这种方法特别适用于含有杂种多肽菌落的分析。例如一种重组体质粒DNA，产生出由蛋白质A和蛋白质B融合形成的杂种多肽（A-B）。为了从转化子菌落群体中检测出合成这种蛋白质多肽的克隆，可把抗（A-B）杂种多肽A蛋白质部分的抗体固定在固体基质上，最简便的方法是直接涂抹在聚乙烯的平皿上。再把抗（A-B）杂种多肽B蛋白质部分的第二种抗体在体外用放射性同位素标记上，作为检测抗体使用。

2）非放射性抗体测定法

非放射性抗体测定技术的发展得益于非放射性标记物广泛成功的应用。例如，可以采用直接与辣根过氧化物酶（HPR）或碱性磷酸酶（AP）偶合的第二抗体，检测目的蛋白抗原-抗体复合物。也可采用与HRP偶联的抗生物素蛋白来检测与生物素偶联的第二抗体等。这些方法也称为酶联免疫检测分析法（ELISA），具有较高的灵敏度和特异性，也没有使用放射性核素标记物带来的半衰期短和安全防护等问题，是一类很有发展前途的检测方法。

2.免疫沉淀测定法

免疫沉淀测定法也可用于筛选含目的基因的克隆子。该方法操作简便，但灵敏度不高，实用性较差。

其做法如下：在生长菌落的琼脂培养基中加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体，如果被检测菌落的细菌能够分泌出特定的蛋白质，那么在它的周围，就会出现一条由一种叫做沉淀素（precipitin）的抗原-抗体沉淀物所形成的白色的圆圈（图6-11）。在含有特异性抗半乳糖苷酶抗体的琼脂培养基平板上，生长着分泌半乳糖苷酶的菌落。图6-11中，（a）显示每个菌落的周围都环绕着一圈沉淀素带；（b）显示Lac+菌落的周围有一圈沉淀素带，而在Lac-菌落的周围则没有沉淀素带。

3.表达载体产物的免疫化学检测法

现在已经发展出一套专门适用于免疫化学检测技术的表达载体系统。由于这些表达载体都是专门设计的，插入它上面的真核基因所编码的蛋白质都能够在大肠杆菌宿主细胞中表达，所以最适宜于用免疫化学技术进行检测。应用免疫载体pUC8，配合免疫化学检测法，已成功地克隆编码小鸡的原肌球蛋白（tropomyosin）β链的cDNA。

由于在pUC8表达载体分子上紧靠EcoRⅠ位点的左侧有一个很强的lac启动子，克隆在pUC8 lac启动子右侧的所有的cDNA，只要它的取向是同启动子转录方向一致，就能够正常转录和转译。所以凡是在转化中捕获了具有cDNA插入的pUC8质粒的细胞都能够产生出真核的蛋白质。转化子菌落用氯仿蒸气处理之后，再用125I标记的抗原肌球蛋白的抗体进行免疫筛选。分泌原肌球蛋白的菌落会同标记的抗体结合，于是经过放射自显影，便可检测出能够分泌小鸡原肌球蛋白的克隆。