8.3.2 杆状病毒表达系统的效率与加工能力
以杆状病毒为载体的昆虫细胞表达系统是经过人工修饰的高效基因表达系统，可用于外源蛋白的大规模生产。与其他细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比，Baculovirus昆虫细胞表达系统的优点如下。
（1）可以使外源基因超高效表达。Baculovirus多角体蛋白基因和P10基因都有强启动子且为非必需基因，被外源基因置换后不会影响病毒复制和增殖。
（2）适于表达细胞毒性蛋白。杆状病毒表达系统所用的启动子多为NPV极晚期基因启动子，外源基因的表达是在病毒成熟之后进行，故外源细胞毒性蛋白的表达不会影响病毒复制。
（3）容纳外源基因片段的能力大。10 kb左右的外源基因仍可在多角体蛋白启动子的调控下表达，这是其他载体无法比拟的。
（4）外源蛋白生物活性高。在昆虫细胞中所表达的外源蛋白可以进行翻译后修饰和加工，表达产物在结构、活性、抗原性、免疫原性方面与天然蛋白很相似，适合于生产药用蛋白。
（5）由于NPV的宿主范围很窄，不会感染脊椎动物和植物，重组体只能在昆虫体内细胞间传播，因此重组杆状病毒具有安全性。
当然，昆虫细胞表达系统也同样有其不足之处。由于NPV感染昆虫细胞导致宿主死亡，因此外源基因的表达出现不连续性，即每一轮蛋白质合成均需重新感染新的昆虫细胞；许多蛋白质是在病毒侵染晚期才进行胞内加工，并且会影响某些蛋白质的修饰过程，此时由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，细胞质内的物质释放出来，与目的蛋白混合使后续的纯化工作变得很困难；与此同时，细胞内的蛋白水解酶也会降解重组蛋白。此外，昆虫细胞的糖基化方式与哺乳动物细胞的糖基化方式存在一定的差异，前者多为简单的、不产生分支的、高甘露糖含量的结构。所以在昆虫细胞表达系统中表达出的部分蛋白质与其天然蛋白在结构上仍然存在着差异，可能影响到重组蛋白的活性和免疫原性，这些问题有待于进一步的研究。
为了进一步提高杆状病毒表达系统的效率与加工能力，可以从以下几个方面进行研究。
1.提高外源基因表达效率
针对杆状病毒表达系统的上述问题，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒IE-1基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统使这些问题有了改观，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：一个是家蚕（Bombyx mori）肌动蛋白基因启动子；另一个是家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的早期基因IE-1，编码的IE-1蛋白是一种可激活肌动蛋白基因启动子的转录激活因子；BmNPV的同源序列3（homologous region 3，HR3）可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。此外，BmNPV与AcNPV杂合的多角体病毒（HyNPV）也被用于昆虫细胞表达系统的构建。
以前以为杆状病毒是节肢动物专性病毒，仅能感染鳞翅目昆虫细胞，不能在其他昆虫细胞（如果蝇细胞）中进行复制，然而后来通过研究表明，在一定条件下杆状病毒也能感染果蝇细胞。杆状病毒-S2表达系统就是以果蝇S2细胞为宿主细胞的重组杆状病毒表达系统。该系统的表达载体利用果蝇启动子，如热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中HSP70启动子的作用最强。果蝇S2细胞被重组杆状病毒感染后不会引起细胞裂解，且蛋白质表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。并且杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白与HSP70共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果前体多肽在没有到达内质网时就已经伸展开并暴露出疏水残基，就很容易通过残基间的疏水相互作用形成多肽聚集体，影响外源基因表达产物的加工和分泌。当外源蛋白与HSP70共表达时，HSP70具有分子伴侣的作用，可协助细胞内分子组装和蛋白质折叠，可以与新合成的多肽结合帮助其正确折叠，抑制前体肽的聚集体形成，使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白质的分泌水平。使用杆状病毒-昆虫细胞系统可生产人类乳头状瘤病毒样颗粒疫苗，还可生产一种美国批准使用的、由重组血凝素组成的季节性接种疫苗。以杆状病毒为载体的昆虫细胞表达系统由于具有操作安全、表达量高等特点，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域。
2.增强宿主细胞蛋白糖基化修饰能力和蛋白前体加工能力
糖基化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后加工形式，可对蛋白质分子结构及生理生化特征产生重大影响。蛋白质分子表面的糖链分子与蛋白质的抗原性、分子识别以及生理活性和稳定性有密切关系，因此要获得与天然的蛋白质糖基化相同的外源基因表达产物，宿主细胞蛋白糖基化修饰能力是一个很关键的因素。糖基化在细胞免疫、信号转导、蛋白质降解等诸多生物过程中起着重要作用。作为一类在基因工程中得到广泛应用的真核表达系统，昆虫细胞表达系统具有与多数高等生物类似但又有所不同的翻译后加工修饰过程，其蛋白糖基化修饰较简单，一般只能形成高甘露糖型和寡甘露糖型糖链，对于带有唾液酸或是半乳糖等复杂构型的糖链，昆虫细胞表达系统难以生成，因此糖基化水平低成为该系统的主要缺陷。根据糖链和肽链连接方式的不同，蛋白质的糖基化可以分为N-糖基化和O-糖基化两种。蛋白质的糖基化是在糖基转移酶的作用下将糖基从供体转移到受体肽链的特定部位形成N-糖基化和O-糖基化的糖蛋白。昆虫细胞表达系统所表达的外源蛋白与真核蛋白具有相同的糖基化位点，但形成的糖链有所不同，其原因是昆虫细胞中的糖基供体主要是由游离单糖分子与核苷形成的“糖-核苷”，包括UDP-Gal和UDP-GlcNAc等糖基供体，但缺乏“唾液酸-核苷”（CMP-Neu5Ac）供体。因此，昆虫细胞并不能在N-连接糖蛋白中加入半乳糖或末端唾液酸残基形成复杂型的糖链，杆状病毒系统不能用于生产大量重要的哺乳动物蛋白。
昆虫细胞缺乏唾液酰基转移酶和β-1，4-半乳糖苷转移酶这两种酶，表达的糖蛋白将不能形成半乳糖和唾液酸型糖链。由于不同的昆虫细胞内含有的糖基转移酶种类不同，从而导致糖基化的能力不同，因此选用不同的昆虫细胞系是拓展昆虫杆状病毒系统糖基化处理能力的有效方法之一。另外，Altmann等发现N-乙酰氨基葡萄糖苷酶能够降解蛋白的多糖侧链，因此抑制N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性也是提高表达蛋白糖基化程度的一个途径。将哺乳动物糖基化酶基因引入野生杆状病毒载体，用于建立稳定的昆虫细胞系，有助于提高外源基因表达产物的活性。利用此技术已经成功获得了多种转基因昆虫细胞系，其中糖基化潜力最强的Sf-SWT-3转基因昆虫细胞系除了编码五种普通的糖基转移酶外，还可以编码鼠科的两种酶，即鼠唾液酸合成酶（saliva acid synthase，SAS）和CMP唾液酸合成酶（CMP-SAS）。如果缺乏这两种酶，将不能使唾液酸前体和N-乙酰甘露糖苷转变为CMP-唾液酸，糖基转移酶缺乏供体，形成的糖蛋白与天然蛋白结构上有较大差异。
异源蛋白前体在许多情况下不能在昆虫细胞中进行正确加工，因此无法形成活性蛋白。利用哺乳动物细胞中的蛋白前体转化酶、菲林蛋白酶（furin）来增强昆虫细胞的蛋白前体加工能力，可以改善昆虫细胞基因表达系统的性能。将编码该酶的基因置于杆状病毒载体的多角体蛋白基因的启动子下游，与带有前体蛋白基因序列的杆状病毒表达载体共转染昆虫细胞，就可以产生有活性的目的蛋白。
3.筛选细胞溶解能力低的杆状病毒
利用显微镜技术可以在杆状病毒感染昆虫细胞3～5 d后观察细胞溶解的状况，由于细胞破碎可能释放大量的蛋白酶，导致重组蛋白的迅速降解，这一因素限制了昆虫细胞杆状病毒表达系统的效率。因此，筛选细胞溶解能力低的杆状病毒对于提高昆虫细胞杆状病毒表达系统的效率至关重要。通过随机诱变和荧光能量共振转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）试验进行目的突变的选择，从杆状病毒的突变株中筛选到细胞溶解能力降低了的杆状病毒株。与亲代病毒的细胞溶解能力相比较，草地夜蛾Sf-21细胞被突变病毒感染5 d后细胞的溶解率只有7％，而亲代病毒感染的细胞溶解率达到60％。显然利用这种病毒作为表达载体可以显著降低蛋白质降解水平，提高外源基因表达的效率。减少蛋白质降解的另一种方法是开发缺失几丁质酶和组织蛋白酶（v-cathepsin）的穿梭载体。用这种杆粒设计的重组病毒作为穿梭载体可以保护分泌性重组蛋白使其免受降解。