6.3.5　转译筛选法

转译筛选法可分为杂交选择的转译（hybrid-selected translation）和杂交抑制的转译（hybrid-arrested translation）两种不同的筛选策略。它们的突出优点是，能够弄清楚克隆的DNA同其编码的蛋白质之间的对应关系。这两种方法都要通过无细胞翻译系统（cell-free translation system）检测经处理后的mRNA的生物学功能。常用的无细胞翻译系统有麦胚提取物系统和网织红细胞提取物系统。在无细胞翻译系统中，若是由加入的mRNA指导转译的新蛋白质多肽，将会掺入35S-甲硫氨酸而具有放射性。经凝胶电泳分离成区带，进行放射自显影，在X光片的曝光区带，即间接说明mRNA的种类和活性。

1.杂交抑制的转译筛选法

这种筛选法所依据的原理是，在体外无细胞转译系统中，mRNA一旦同DNA分子杂交，就不能够再指导蛋白质多肽的合成，即mRNA的转译被抑制了。在高浓度甲酰胺溶液的条件下（这种溶液既有利于DNA-RNA的杂交，同时又能抑制质粒DMA的再联合），将从转化的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体中制备来的带有目的基因的重组质粒DNA变性后，同未分离的总mRNA进行杂交。把从杂交混合物中回收的核酸，加入无细胞转译系统（如麦胚提取物或网织红细胞提取物等）进行体外转译。由于其中加有35S标记的甲硫氨酸，转译合成的多肽蛋白质可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分析，并把其结果同未经杂交的mRNA的转译产物比较，从中便可以找到一种其转录合成被抑制了的mRNA，这就是同目的基因变性DNA互补而彼此杂交的mRNA。根据这种目的基因编码的蛋白质转译抑制作用，就可以筛选出含有目的基因的重组体质粒的大肠杆菌菌落群体（或噬菌斑群体）。然后将这个群体分成若干较小的群体，并重复上述实验程序，直至最后鉴定出含有目的基因的特定克隆为止。杂交抑制的转译筛选法是一种很有效的手段，它能够从总mRNA逆转录生成的cDNA群体中检出所需的目的cDNA，因而特别适用于筛选那些高丰度的mRNA。

2.杂交选择的转译筛选法

杂交选择的转译也称杂交释放的转译（hybrid-released translation），是一种更敏感的方法，可用于检出低丰度的mRNA（占总mRNA的0.1％）。其基本做法是从克隆文库中挑取转化菌落或噬菌体群体，分离制备其质粒DNA分子，经适当处理后牢固结合在硝化纤维素滤膜上。然后用同一菌落或噬菌体群体的mRNA（甚至是总的细胞RNA）进行杂交。通过洗脱作用，分离出能与结合的DNA分子杂交的mRNA。如果用于杂交的DNA分子并非是固定在固相支持物上，而是处于溶液状态，则可通过柱层析从总mRNA中分离出杂种分子。回收杂交的mRNA，加到无细胞翻译系统中进行体外转译，通过凝胶电泳分析或根据生物活性鉴定转译合成的带放射性标记的多肽产物。一旦获得某种呈阳性反应的克隆群体，可将它分成许多小库，直到用划线培养法获得一个或数个呈阳性反应的单菌落重组子为止。