8.3.1 以重组杆状病毒为载体的昆虫细胞表达系统
与微生物表达系统相比，Baculovirus昆虫细胞表达系统拥有得天独厚的优势。昆虫细胞不同于微生物细胞和酵母细胞，它们能像哺乳动物细胞一样，在翻译蛋白质之后对真核生物的蛋白质进行折叠和修饰。它们同样适合表达细胞内的哺乳动物蛋白，如激酶和分泌性蛋白，某些可能对哺乳动物宿主细胞产生抑制或毒性等副作用。最常用的Baculovirus昆虫细胞表达系统是Baculovirus expression vector system（BEVS），由得克萨斯A&M大学的Max Summers、Gale Smith和其同事开发完成。用BEVS能在短时间内制备大量翻译后修饰的真核生物蛋白。Baculovirus的基因组为双链环状DNA，长度是80～220 kb。每种杆状病毒的宿主专一性强，不会感染脊椎动物和植物细胞。杆状病毒DNA具有大量的非复制必需区，可容纳较大的外源DNA片段，使昆虫杆状病毒载体具有广阔的应用前景。
1.转移载体质粒的构建
昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA病毒，由于基因组太大，其载体需要通过组建重组病毒来获得，主要包括以下两个步骤。
（1）构建转移载体（transfer vector）。转移载体的基本结构中含有杆状病毒启动子和外源基因插入位点，通常是将含有强启动子的基因及其旁侧序列（如NPV多角体蛋白基因）克隆入一个质粒载体，然后通过修饰以便能使要克隆的外源目的基因在启动子的控制下表达融合蛋白或非融合蛋白。
（2）将携带外源基因的转移载体及野生型NPV DNA共转染昆虫培养细胞，在转染细胞内自发进行DNA同源重组，野生型病毒的相关序列（如多角体蛋白基因）被重组DNA替代。最后利用重组病毒感染细胞噬斑与野生病毒感染噬斑的形态差异，进行空斑分析，镜检筛选纯化出重组病毒。以纯化的重组病毒感染宿主细胞或幼虫，可获得大量的外源基因表达产物。
转移载体质粒构建方法有多种，一种是利用多角体蛋白基因启动子构建转移载体，此外也可以用来自家蚕核型多角体病毒的P10基因启动子或者AcMNPV碱性蛋白基因启动子来组建转移载体。
利用多角体蛋白基因启动子通过各种修饰可以组建表达非融合蛋白或融合蛋白的转移载体。载体中的多角体蛋白启动子的14 bp保守序列可对外源基因的表达进行调控；其上游的5'前导序列—70～—1 bp也是外源基因高水平表达所必需的；在多角体蛋白基因的起始密码子ATG下游+4 bp位点处插入外源基因，其表达水平会更高；将多角体蛋白基因部分编码序列与外源基因融合，则外源基因的表达接近天然多角体蛋白的表达水平。外源基因插入片段中ATG上游的非翻译序列应该尽可能缩短，否则不利于外源基因的高效表达。如pUBM-4和pBMX-3就是以家蚕多角体蛋白强启动子为基础构建的。转移载体根据表达外源基因的能力可以分为单一表达载体和多元表达载体。目前用于表达多个外源基因的多功用载体有pBacPAK8、pBacPAK9、pBac Ⅲ和pBlue-BacHls等。由Clontech公司开发的pBacPAK-His杆状病毒表达载体在多克隆位点插入外源基因，使其位于多角体蛋白强启动子的下游，通过与BacPAK6病毒基因组共转染Sf-21细胞进行同源重组。pBlue-BacHls转移载体在其多角体蛋白起始密码ATG下游有一个编码6个组氨酸的序列和一个肠激酶（enterokinase）切割位点。用该转移载体组建重组病毒来表达的外源蛋白在纯化时，其组氨酸与亲和层析柱的镍螯合，肠激酶用于切去位于融合蛋白N端的金属结合结构域（或组氨酸片段），该处是肠激酶切割位点。同样可以将外源蛋白基因与谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因重组进行融合表达，形成的融合蛋白通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱来进行纯化。
杆状病毒的极晚期基因P10与polh一样，是病毒复制非必需的基因，P10基因启动子也可用于外源基因的表达。P10位点常被用作外源基因插入点，用P10基因启动子及其旁侧序列构建转移载体来克隆外源基因，与野生型NPV共转染时，外源基因通过同源重组替代病毒P10基因，在P10基因启动子控制下进行表达。由于BmNPV的P10基因与AcMNPV的P10基因具有相当高的同源性，构建了BmNPV P10和AcMNPV P10的联合载体pBmAcPV-1。这个载体的Bgl Ⅱ限制性核酸内切酶位点用于外源基因的插入，其上游为BmNPV P10基因启动子部分及其5'端，而Bgl Ⅱ的下游为AcMNPV的P10基因的3'端部分。由于AcMNPV和BmNPV的P10的结构基因及两端序列的同源性高达90％以上，因此同一个载体不仅可以和野生型的AcMNPV DNA重组表达外源基因，而且可以和野生型的BmNPV DNA重组表达外源基因。这将为进一步研究BmNPV和AcMNPV之间的关系提供有效的方法和材料，同时也为载体的构建提供新的方法和途径。晚期基因表达相对较迟，不利于表达产物的翻译后加工。此外，对P10蛋白的合成与否缺少可识别的表型差异，不便于筛选重组病毒，该类载体目前使用较少。
除了P10基因启动子用于转移载体构建以外，其他的一些基因（如早期及晚期基因）其启动子也可用于构建表达载体。如早期基因IE-1启动子也被广泛应用于外源基因的表达，由Invitrogen公司用黄杉毒蛾杆状病毒（OpNPV）早期启动子IE-1构建的商品化载体pIZT/V5-His已进入市场。由于NPV早期基因产物一般是NPV的调控或结构蛋白，因此构建重组病毒不能删除或失活原有基因，而是在病毒基因组的某一非必需位点增加一个上述基因启动子拷贝，以驱动外源基因表达。AcMNPV的碱性蛋白基因启动子替换常规载体中的多角体蛋白基因启动子，并仍然使用多角体蛋白基因的两侧序列，与野生型NPV DNA同源重组，使外源基因在此碱性蛋白基因启动子控制下在感染晚期进行表达。此外，融合或修饰的启动子如p39-P-Pn型融合启动子，可使基因表达效率提高。家蚕的丝心蛋白基因启动子被认为是自然界最强的启动子，但其介导的基因高效表达会干扰宿主细胞的正常生理。
2.重组病毒的组建和筛选
重组病毒实际上是通过野生型病毒DNA与携带外源目的基因的转移载体DNA之间的同源重组而产生的。将野生型病毒和转移载体共转染培养的昆虫细胞系后，通过同源重组完成重组病毒的组建并将外源基因与病毒DNA的重组子导入宿主细胞内。目前广泛使用的转染方法有两种：一种是磷酸钙共沉淀法；另一种是阳离子脂质介导法。磷酸钙共沉淀法操作简单，直接将溶于磷酸缓冲液中的DNA混合物同CaCl2混合，形成的磷酸钙沉淀与DNA结合成为共沉淀颗粒。这些DNA共沉淀物加入培养细胞后被细胞摄取，在细胞内通过同源重组形成重组病毒。阳离子脂质介导法则是利用脂转染物（lipofectin）能自发地与DNA作用形成脂-DNA混合物的特点，将DNA完全包裹形成脂质体，然后加入不含血清的生长培养基中，脂质体与细胞膜融合后介导DNA进入细胞。该方法的转染效率比磷酸钙共沉淀法高5～100倍。
传统的杆状病毒系统是利用转移载体与野生型病毒DNA在昆虫细胞内发生同源重组产生重组病毒DNA。以昆虫细胞作为重组介质，转染率高，不易出现假阳性。其缺点是同源重组率非常低，只有0.5％～1％，操作烦琐，要通过3～5轮的空斑筛选才能完成重组病毒的分离和纯化。这些局限使得该技术无法大规模地使用，特别是用于不同种类蛋白质的大量表达。随着研究的深入，在20世纪90年代开发了病毒线形化技术，使得同源重组效率有所提高。所谓病毒线形化，就是将野生型病毒的双链环状DNA切开，使其变成线状双链DNA，通过与转移载体发生同源重组“救活”病毒。该技术无法使病毒DNA全部切割成线状DNA，仍然有一些非重组病毒需要用局限空斑分析法来排除。近年来出现的一些新技术，酵母-昆虫细胞穿梭载体系统、Bac-to-Bac杆状病毒表达系统、Gateway克隆系统和Cre-lox重组系统等，使重组病毒构建和筛选的过程变得更加容易。下面对这些新技术进行简单介绍。
（1）酵母-昆虫细胞穿梭载体系统：1992年Patel等开发出酵母-昆虫细胞穿梭载体系统，其主要原理是利用在酵母中可以复制的杆状病毒基因组DNA和含有外源基因和酵母DNA片段的转移载体进行重组并筛选重组病毒，重组病毒再转染昆虫细胞，使外源基因表达形成重组蛋白。通过重组将酵母的自主复制序列（ARS）、着丝粒区段（CEN）和选择标记URA3基因（内源乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶基因）置入重组病毒基因组中，在酵母中将反选择标记SUP4-0重组到病毒中形成穿梭载体。将穿梭载体和5'端携带杆状病毒序列及3'端为酵母ARS的转移载体在酵母中发生重组，使外源基因替代SUP4-0基因。而含有缺失SUP4-0的重组穿梭载体的酵母能在含有精氨酸类似物刀豆氨酸（canavanine）的培养基中生长，因此只需选择抗刀豆氨酸的酵母克隆即可获得可表达外源基因的重组病毒，过程简单且便于操作。
（2）Bac-to-Bac杆状病毒表达系统：1994年Luckow等提出了一个利用转座子介导提高重组效率的新思路。利用细菌转座子在大肠杆菌内快速构建重组杆状病毒，是迄今为止最为方便、快捷的重组杆状病毒筛选方法，这也是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的优点。“Bac-to-Bac”意为从细菌到杆状病毒，该技术使重组杆状病毒的构建方法发生了革命性改变，所使用的大肠杆菌-杆状病毒穿梭载体称为杆粒（bacmid），即杆状病毒-质粒杂合子（Baculovirusplasmid hybrid molecule）。其基本原理如下：首先将mini-F复制子、卡那霉素抗性基因、lac Z'和细菌Tn7转座子的靶序列共同引入polh基因内，形成E.coli-昆虫细胞穿梭载体（杆粒），然后转化大肠杆菌，在辅助质粒提供转座蛋白的情况下，供体质粒上带有两个结合位点的外源目的基因表达盒能以极高的效率转座到杆粒，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。由于供体质粒带有的基因表达盒和卡那霉素抗性基因的DNA片段整合到杆粒后破坏了lac Z'基因的读码框，在IPTG和X-Gal存在时，带有重组杆粒的菌株将形成白色菌落。最后利用重组杆粒DNA转染昆虫细胞，即可使外源基因表达形成重组蛋白。
目前还有成功适用于家蚕的Bac-to-Bac表达系统。首先在BmNPV病毒的多角体基因位点插入含细菌单拷贝mini-F复制子、编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段（lac Z'）和卡那霉素抗性基因的片段，形成家蚕的BmBacmid。用BmBacmid转化的大肠杆菌DH103称为BmDH1OBac。利用与大肠杆菌类似的利用颜色的改变进行鉴别的蓝白斑筛选法对重组子进行鉴别，重组子转染家蚕细胞即可获得表达的重组蛋白。
（3）Gateway克隆系统及Cre-lox重组系统：由美国Invitrogen公司开发的Gateway克隆系统是基于λ噬菌体位点特异重组的原理，产生所需要的重组子。进入溶源周期中的λ噬菌体可以通过attP位点在整合酶的作用下整合到大肠杆菌基因组的attB位点而成为溶源噬菌体（称为BP反应），而当进入裂解周期时溶源噬菌体也可从大肠杆菌基因组上切离下来（称为LR反应）。BP反应使得噬菌体的序列整合进入宿主染色体，LR反应相反，是从基因组上脱离。无论是BP反应还是LR反应，都是通过特定位点和辅助因子的参与才能实现，BP和LR两个反应构成Gateway技术的核心。经过改造将attR位点构建在BaculoDirectTM线状DNA（杆状病毒基因组）之中，用于与带有目的基因的entry克隆载体进行有效重组。将entry克隆、BaculoDirectTM线状DNA和Gateway LR clonaseTM酶混合均匀，在室温下反应1h即可用于转染昆虫细胞。操作步骤简单，整个过程仅需要8 h。
利用P1噬菌体的特异性Cre-lox重组系统可构建体外重组表达载体系统是基于P1噬菌体编码的Cre重组酶可以特异性识别loxP（由34个碱基对构成的一个反向重复序列）序列并与之重组的原理。通过同源重组将人工合成的loxP序列整合到NPV的基因组中形成重组病毒NPV（loxP+），在体外经Cre重组酶催化重组病毒NPV（loxP+）可与含loxP序列的转移载体进行位点特异性重组，转染细胞后可以形成重组病毒。