2.3.5　逆转录酶

逆转录酶，又称反转录酶，是以RNA为模板的DNA聚合酶的统称，又称依赖于RNA的DNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase），或RNA指导的DNA聚合酶（RNA directed DNA polymerase）。能以RNA为模板，催化合成互补的DNA（complementary DNA，cDNA）单链，进而合成DNA第二链。在该酶催化反应中，遗传信息传递的方向是从RNA到DNA，正好与转录过程相反，所以称之为逆转录酶。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了逆转录酶，并因此获得了1975年的诺贝尔生理学或医学奖。逆转录酶的发现对遗传工程技术起到巨大的推动作用，逆转录酶是研究真核或者原核生物目的基因，构建cDNA文库等实验不可或缺的工具，与Taq DNA聚合酶等共同构成现代生物技术的基础工具酶。

目前，已经商品化的逆转录酶主要有两种：一种是禽源的，来源于禽成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）；另一种是鼠源的，来源于Moloney鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，Mo-MLV）。AMV逆转录酶由2条多肽链组成，其相对分子质量分别为65000和95000，具有5'→3'聚合酶活性和很强的RNase H活性，该酶在42℃（鸡的正常体温）能有效地发挥作用，在pH值为8.3时活性高，能有效地复制较复杂的mRNA。Mo-MLV逆转录酶是单链多肽，相对分子质量为71000，具有5'→3'聚合酶活性和很弱的RNase H活性，该酶在42℃时会迅速失活，在pH值为7.6时更有利于发挥作用，其基因工程产品纯度高。

逆转录酶的活性包括：5'→3'聚合酶活性（需Mg2+），即以RNA或DNA为模板，以带有3'-OH的RNA或DNA为引物，沿5'→3方向合成DNA；5'→3'和3'→5'RNA外切酶活性（RNase H活性），能够从5'或3'端特异性地降解DNA-RNA的杂交链中的RNA链，进而保留新合成的DNA链。在商品化的逆转录酶中，类似于RNase H的活性已经被去除，只保留聚合酶活性。

逆转录酶是基因工程中最重要的工具酶之一，主要用于：①以mRNA为模板合成其互补DNA（cDNA），用于构建cDNA文库，进行基因克隆等；②对具5'端突出的DNA片段进行补平和标记，制备杂交探针；③代替Klenow DNA聚合酶或测序酶，用于DNA序列分析。