6.1.3 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞表面的结构和组成均与革兰氏阳性菌有所不同，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子，而非来自供体菌游离DNA片段（转化因子），因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化实验中，很少采取自然转化处理。其常用的方法如下。
1.化学转化法
1）大肠杆菌的感受态细胞
将重组体DNA导入感受态大肠杆菌的转化实验，是一种十分有效的导入外源DNA的手段，转化实验包括制备感受态细胞和转化处理。
对细菌细胞进行转化或转染的关键是细胞处在感受态。所谓感受态细胞，就是指受体细胞处于摄入外源DNA的状态。一般用0.01～0.05 mol/L CaCl2处理受体细胞，可以引起细胞膨胀，增大细胞的通透性，使重组DNA进入细胞，提高转化效率。
感受态细胞无特异性，对各种外来DNA都可接受。缺乏标记的重组DNA可与有识别标记的DNA同时转化（非亲缘关系），以有利于转化体的筛选。
2）感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的具体制备方法如下：
（1）从37℃培养16～20 h的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径为2～3 mm）转到一个含有100 mL LB的烧瓶中，于37℃剧烈振摇（300 r/min）培养3h，使细胞的浓度达到5×107个/mL，这时，细菌的OD600一般在0.2～0.4，为对数生长期或对数生长前期。可每隔20～30 min测量OD值来检测培养物的生长情况。
（2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的、一次性使用的、用冰预冷的50 mL聚丙烯管中，在冰上放置10 min，以下所有步骤均需无菌操作。
（3）于4℃以4000 r/min离心10 min，回收细胞。
（4）倒出培养液，将管倒置1 min，以使残留的痕量培养液流尽。
（5）用10 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬每份沉淀，然后放置于冰浴30 min。
（6）于4℃以4000 r/min离心10 min，回收细胞。
（7）倒出培养液，将管倒置1 min，以使残留的痕量培养液流尽。
（8）每50 mL初始培养物用2 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，然后放置于冰浴上10～30 min。
（9）于4℃以4000 r/min离心10 min，回收细胞。
（10）倒出培养液，将管倒置1 min，以使残留的痕量培养液流尽。
（11）分装细胞，若不马上进行转化，该感受态细胞可以加入终浓度为10％～30％的灭菌甘油于—70℃冻贮。
3）重组体向受体细胞的导入
感受态细胞的转化效率在24 h内最高，因此转化反应最好紧接其后。若不马上转化，感受态细胞应置于终浓度为15％的灭菌甘油内，—70℃下可保存1～2个月，—20℃下可保存2～3周，总之储存时间越短越好。
将重组质粒DNA分子与大肠杆菌感受态细胞混合，置于冰浴中一段时间，再转移到42℃下进行短暂（约90 s）的热刺激后，迅速置于冰上，向其中加入非选择性的肉汤（SOC）培养基，保温振荡培养一段时间（1～2 h），使细菌恢复正常生长状态，以促使在转化过程中获得的新抗生素抗性基因（Ampr或Tetr）得到充分表达。该法转化效率一般可达每微克DNA 105～106个转化子。
重组体DNA分子的转化通常还包括以噬菌体、病毒或以其作为载体构建的重组DNA分子导入细胞的过程（转染过程）。具体操作比质粒DNA的转化要简单，即将重组的噬菌体DNA分子同预先培养好的大肠杆菌细胞混合，37℃保温约20 min，直接涂布在琼脂平板上，经过一段时间之后，重组噬菌体DNA就在大肠杆菌细胞中复制增殖，最终在平板上形成噬菌斑。
2.电穿孔法
电穿孔法有专门的仪器，但影响导入效率的因素较多，故需优化操作参数。电压太低时，不能形成微孔，DNA无法进入细胞膜；电压太高时，易导致细胞的不可逆损伤。故电压多在300～600 V/cm。脉冲时间一般为20～100 ms，温度以0～4℃为宜，可使穿孔修复迟缓，增加DNA的进入机会。电穿孔法的特点是操作简单，不需制备感受态细胞，适用于任何菌株。其转化效率一般可达每微克DNA 109个转化子。