6.3.6　亚克隆分析法

阳性重组子一经筛选并鉴定出来后，接下来的工作就是目的基因的定位研究。因为克隆片段与整个目的基因很难完全吻合，一般较小的目的基因或cDNA基因可以完整地包含在克隆片段内，而较大的目的基因可能分散在不同的克隆片段中。基因定位研究是对重组DNA分子进行遗传分析的重要内容，也是进一步分析目的基因的基本前提之一，虽然采用限制性核酸内切酶酶切图谱法或Southern印迹法等可以将基因定位在某一限制性片段上，但更为精确和有特别价值的方法是亚克隆分析法。

所谓亚克隆或次级克隆（subcloning），是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆。一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后，将所得各片段分别重组到载体上，再转化宿主细胞，通过对转化细胞的表型鉴定或其他方法来确定基因所在的位置。

如果目的基因两端含有合适的限制性核酸内切酶识别位点，这可根据限制性核酸内切酶酶切图谱分析获得有关信息，那么仅筛选或鉴定少数转化子就能得到所需的亚克隆子。如果含有目的基因的克隆DNA片段的限制性核酸内切酶酶切图谱尚未阐明，仅选用某一种限制性核酸内切酶处理克隆DNA片段，则其识别和切割位点可能出现在目的基因内部，造成目的基因片段分散在两个或两个以上的亚克隆子中，难以获得含有完整目的基因的重组子亚克隆。这时可选用多种不同的限制性核酸内切酶对克隆DNA片段进行处理，然后进行探针杂交，如果在某个限制性核酸内切酶的酶切片段中只有一条大于目的基因的杂交阳性带，则这个片段有可能包含完整的目的基因，任何出现两条或多条杂交阳性带的限制性核酸内切酶以及出现小于目的基因长度的均可被排除。探针的分子越大，这种检测方法就越有效。如果目的基因的两端区域没有合适的酶切位点，也可利用Bal31核酸酶从重组分子中一端或两端同时进行逐步切割以缩短非目的基因区，根据新产生的重组子的遗传表型消失与否或者根据测定的DNA序列决定降解反应的程度，并最终获得含有目的基因的最小DNA片段。