6.3.3 核酸分子杂交检测法
核酸分子杂交的基本原理：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段（称为探针）。这也是目前应用最为广泛的一种重组子的筛选方法，只要有现成可用的DNA探针或RNA探针，就可以检测克隆子中是否有目的基因。基本做法是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上，这个过程也称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合，洗去其他非特异性结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。
核酸分子杂交检测法实际上是一种依赖于重组子结构特征进行的重组子筛选方法，鉴于其应用的广泛性及形式的多样性，本节单独予以介绍。根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落（或噬菌斑）印迹原位杂交、斑点（或狭线）印迹杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交四类，分述如下。
1.Southern印迹杂交
Southern印迹杂交是由E.Southern于1975年首先建立并使用的。它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。Southern印迹杂交是针对DNA分子进行的印迹杂交技术，有时又称为DNA印迹杂交或Southern DNA印迹杂交等。
Southern印迹杂交的一般操作步骤如图6-8所示。首先将进行DNA电泳分离的琼脂糖凝胶，经过碱变性等预处理之后平铺在用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加上一叠干燥滤纸或吸水纸，最后压上一重物。由于于燥滤纸或吸水纸的虹吸作用，凝胶中的单链DNA便随着电泳缓冲液一起转移，一旦同硝酸纤维素滤膜接触，就会牢固地结合在它的上面，这样在凝胶中的DNA片段就会按原谱带模式吸印到滤膜上。在80℃下烘烤1～2 h，或采用短波紫外线交联法使DNA片段稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。然后将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中进行核酸杂交。这些探针是同被吸印的DNA序列互补的RNA或单链DNA，一旦同滤膜上的单链DNA杂交，便可以牢固结合。漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放射自显影后，便可鉴定出与探针的核苷酸序列同源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA的重组子筛选出来。
图6-8 Southern印迹杂交基本操作过程
Southern印迹杂交操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2 ng的DNA也能被清晰地检测出来。因此，Southern印迹杂交技术在分子生物学及基因克隆实验中的应用极为普遍。
2.Northern印迹杂交
Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后，从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法，又称为Northern RNA印迹杂交等。该法是在Southern印迹杂交基础上发展起来的，主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处理，同时，在RNA电泳时必须解决两个问题：一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用，防止RNA分子的降解破坏。
在RNA变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。尿素和甲酰胺会引起琼脂糖固化，故只用于RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳。羟甲基汞对RNA的变性作用效果好，但由于毒性大而不宜采用。乙二醛变性效果较甲醛的好些，杂交后的条带也比甲醛变性凝胶电泳清晰，但在操作上不如甲醛变性凝胶电泳简便，故使用最多的还是甲醛变性凝胶电泳。
甲醛变性凝胶电泳的原理是它能与RNA分子上的碱基结合形成具有一定稳定性的复合物，阻止了碱基间的配对。同时甲醛对蛋白质分子中的亲核基团（如氨基、胍基、巯基等）具一定反应性，可使酶分子失活，防止其对RNA分子的降解破坏。
RNA变性凝胶电泳时一般要求较低的电压，以3～4 V/cm为宜。电泳过程中要注意监测电极液的pH值，由于电极缓冲液的缓冲容量有限，因而电泳一段时间后电极槽中缓冲液的pH值会发生变化，而pH值超过8时，会引起甲醛-RNA、乙二醛-RNA复合物解离。增加缓冲液的离子强度，虽然可以增大缓冲容量，但是会使泳动速度下降，不宜采用。在RNA变性凝胶电泳过程中，缓冲液要不断循环，无循环设备时，每隔30 min左右更换一次缓冲液，或将两槽的缓冲液混合后再分配到两槽中（注意：操作时要关闭电源）。
甲醛变性凝胶电泳时，上样缓冲液中可加入1μg的EB，电泳后凝胶可以直接置于紫外线下观察、照相。如果条带不清晰，可先将凝胶浸泡在0.1×SSC溶液中约20 min，以除去甲醛，然后将凝胶置于含0.5μg/mLEB的0.01×SSC溶液中染色20 min。对于丰度低的RNA及乙二醛变性时，宜采用电泳后染色，因为RNA与溴化乙锭结合后转移效率下降。
Northern印迹转移完毕，取下的固相膜无须漂洗，应立即在室温条件下进行干燥处理，然后于80℃真空烘烤2h以上使RNA固定，经固定结合在膜上的RNA不再对RNase敏感，可长时间保存。由于变性剂的存在会干扰杂交灵敏度，因此在与探针进行杂交前，可以将真空干燥后的固相膜转至20 mmol/L pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液或NH4 Ac溶液中，95℃放置5～10 min，洗脱与RNA结合的甲醛或乙二醛，可明显地提高杂交灵敏度。
3.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹（dot blot）杂交或狭线印迹（slot blot）杂交进行检测，它们是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸（DNA或RNA）分子的核酸杂交技术。两种方法的基本原理和操作步骤相同，即通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交，以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。两者的区别仅在于呈现在杂交滤膜上的核酸样品分别为圆斑状和狭线状。斑点印迹杂交法主要用于基因组中特定基因及其表达情况的定性和定量研究。与其他核酸分子杂交法相比，斑点印迹杂交法具有简单、快速、经济等特点，一张滤膜上可以进行多个样品的检测，同时也适用于粗提核酸样品的检测，但该方法不能用于鉴定所测基因的相对分子质量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。
如果没有特殊的加样装置，也可手工直接点样。将核酸样品变性后，用微量进样器直接点在干燥的显色纤维素滤膜上，点样时应避免样斑过大，一般采用少量多次法加样，待第一次样品完全干燥后，再在原位段第二次点样。如核酸样品为RNA，可采用甲醛变性后点膜，有时RNA样品也可不经变性处理，直接于10×SSC液中点膜；对于DNA样品，可采用碱性缓冲液或煮沸方法变性。
4.菌落（或噬菌斑）印迹原位杂交
与其他分子杂交技术不同，这类技术是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，不必进行核酸分离纯化、限制性核酸内切酶酶解及凝胶电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照其原来的位置转移到滤膜上，然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，因此菌落杂交或噬菌斑杂交属于原位杂交（in situ hybridization）范畴。以菌落原位杂交为例（图6-9），其操作步骤如下：①将大小适宜的硝酸纤维素滤膜铺在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上；②做好标记，小心取出滤膜，将吸附菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上进行溶菌和碱变性处理，强碱可以裂解细菌，释放细胞内含物，降解RNA，并使蛋白质和DNA变性；③10 min后，将滤膜转移至预先被中性缓冲液浸湿的普通滤纸上，中和NaOH；④将滤膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡3 min，洗去菌体碎片和蛋白质；⑤取出滤膜，在普通滤纸上晾干，置于80℃下干燥1～2 h，使单链DNA牢固地结合在硝酸纤维素滤膜上；⑥将滤膜转入探针溶液中，在合适的温度和离子强度条件下进行杂交反应，离子强度和温度的选择取决于探针的长度以及与目的基因的同源程度，一般温度越高，离子强度越小，杂交反应越不易进行，因此对于同源性高并具有足够长度的探针通常在低离子强度和高温度的条件下进行杂交，这样可以大幅度降低非特异性杂交的本底值；⑦杂交反应结束后，清洗滤膜，除去未特异性杂交的探针，然后晾干；⑧将滤膜与X光片压紧置于暗箱内曝光，由胶片上感光斑点的位置，在原始平板上挑选出相应的阳性重组子菌落。
图6-9 菌落原位杂交的操作步骤
一般情况下，在直径为85 mm的平皿上长有100～200个转化菌落时进行原位杂交效果较理想。菌落太多时，容易混杂，导致杂交信号弥散，难以区分菌落位置。可用无菌牙签将相应位置上的菌落挑在少量的液体培养基中，经悬浮稀释后涂板培养，待长出菌落后，再进行一轮杂交，即可获得阳性重组子。如果平皿上菌落太过稀少，也可用无菌牙签将各平皿菌落转至一个平皿上，适当培养后再进行实验。
上述程序用于噬菌斑筛选则更为简单，因为每个噬菌斑中含有足够数量的噬菌体颗粒，可以免去37℃扩增培养，同时由于噬菌体结构简单，不会产生菌体碎片干扰杂交效果，检测灵敏度高于菌落原位杂交。噬菌斑杂交法的另一个优越性是从一个母板上，很容易得到几张含有同样DNA印迹的滤膜，不仅可以进行重复筛选，增加筛选的可靠性，而且可使用一系列不同的探针对一批重组子进行多轮筛选。