9.3.3　种质转化系统

9.3.3　种质转化系统

种质转化系统主要是利用花粉粒及花粉管通道，子房、幼穗及种胚注射外源DNA等方法导入外源基因，又称为生物媒体转化系统，主要包括花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊和子房注射法、萌发种子转化法等。

1.花粉管通道法

花粉管通道法是我国学者周光宇在1979年提出的，其原理是植物授粉后，花粉萌发形成花粉管，外源基因沿着花粉管注入，经过珠心通道进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞，由于它们仍处于未形成细胞壁的类似原生质体状态，并且正在进行活跃的DNA复制、分离和重组，因此很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。

供体DNA大小与纯度、质粒载体、转化受体的雌性器官结构、不同的导入方法、转化时受体受精生理时期等都影响花粉管通道法的转化效率。

周光宇认为DNA片段的相对分子质量以不小于107为宜。过小将有可能得不到带有完整基因的DNA片段，使DNA供体的性状无法表达。外源DNA直接导入技术对DNA纯度要求极高，一般认为DNA样品光密度比值OD260/OD280≈1.8、OD260/OD230＞2，则纯度符合转化要求。不同的植物最适DNA浓度不同。花粉管通道法转化成功与否取决于经花粉管进入胚囊的外源DNA能否参与受精。确定适宜的导入时间，正是利用双受精时卵细胞处于最佳感受态时易于外源DNA的导入和整合，从而完成转化。但由于自然条件复杂多变，如每天不同时段温度、湿度等各有其基本变化规律，不同日期的同一时段又可能有显著的差异，因此，充分考虑各种影响因子、最佳导入时间间隔和时间点，还需因地因时而异。

花粉管通道法包括以下几种具体操作方式。

（1）自花授粉后外源DNA导入植物技术：由周光宇首创，即将供体总DNA（相对分子质量不小于107）的片段，在受体自花授粉后一定时期涂抹于柱头上，使其能沿着花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞。实际应用时一般切除柱头进行涂抹，这样可以减少DNA进入胚囊的距离，提高转化率，但会影响结实率。该项技术应用最广泛，水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等已通过此途径实现了遗传转化。

（2）花粉匀浆涂抹柱头法：张孔恬等用小麦恢复系花粉匀浆缓冲液直接涂抹不育系柱头，获得了恢复系可育性状的转移，首创了花粉匀浆法。该项技术应用较广泛，在小麦、玉米、高粱、花生、番茄上都有应用。

（3）受体花粉与供体DNA混合授粉法：Pandey等以烟草为原料，将供体品种的花粉经γ射线杀死后与受体新鲜花粉混合授粉，结果获得供体花色形状的变异，认为经照射杀死的花粉其遗传物质可不通过配子融合而发生基因转化。Hess应用外源DNA溶液浸泡受体花粉，利用花粉萌发时吸收外源DNA，通过授粉过程导入外源DNA，使子代出现DNA供体的性状。国内这项技术用得不多。

（4）授粉前涂抹DNA法：除受体为雄性不育系外一般事先人工去雄套袋，隔日开花时，用供体总DNA处理受体植株柱头3～5 min，然后授以本株或同品种其他植株花粉。

花粉管通道法局限于开花植物，且只有花期可以进行转育，导入总DNA片段的转育株会带有少量非目的性状的DNA片段。不同植物的花器结构及授粉受精的过程不同，进行导入时需要按不同时间及方法来进行，才能保证有效地实施这一育种新技术，也就是要求寻找合适的DNA导入时期和导入方法。表9-1是一些农作物外源基因导入最佳时期和方法。与其他转基因技术相比，花粉管通道法缩短了育种周期，特别是既可以转化目的基因，又可以进行杂交育种；适用于多种单、双子叶显花植物；利用植物自然生殖过程，避开了植株再生的难题，由于不依赖组织培养，降低了操作的技术难度；不必建立原生质体培养体系、胚性细胞系或悬浮细胞系，育种程序简单易行，进一步降低了转化成本；可以将基因组DNA作为转化载体，故有可能实现多基因同时转化一个细胞，对于植物获得由微效多基因控制的性状有重要意义。

该方法的不足之处在于转化技术不完善、对转化机制缺乏系统的研究、操作过程带有一定的盲目性、不能转化大片段的外源DNA、转化效率较低、只能在开花期应用等。

2.子房注射法

该方法由丁群星等于1993年创立。其原理如下：使用微注射针或显微注射仪将外源DNA注入处于减数分裂期的受体植物的子房中，借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力，外源DNA进入受精的卵细胞中，借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象，外源DNA被随机整合到受体染色体上。目前，子房注射法成功用于玉米、小麦、甜瓜和黄瓜等农作物的转基因育种工作中。

该方法的基本步骤如下：①目的基因的制备；②根据受体植物受精后其子房的变化特点，确定最佳时间，进行外源DNA注射或将离体的受精子房进行外源DNA注射，再对该离体子房进行培养；③转化种子及其后代的检测。

子房注射法的优点如下：不需组织培养过程，因此实验过程简单、操作便捷；该方法所用的仪器设备简单、便宜；外源DNA直接注射进入子房可以提高转化率；该方法可以直接得到转化种子，因此缩短了育种周期。

其缺点如下：田间转化过程的工作量大；转化过程中，子房受到机械性伤害易导致转化率和结实率低；易产生杂基因污染；该方法只能在授粉期进行，受季节和天气等自然条件影响；由于后代群体规模较大，因此筛选过程工作量较大。

3.生殖细胞浸泡法

将植物的种子、胚、胚珠、子房等生殖细胞（有时甚至是幼穗、幼苗等）直接浸泡于外源DNA溶液中，利用渗透作用使外源基因进入受体细胞，并有效整合到受体细胞基因组中，达到遗传转化的目的。浸泡转化中，植物细胞能通过自身的物质运输系统直接吸收外源DNA。研究证明，植物细胞将外源DNA吸入细胞内的途径至少有以下三种：①植物细胞可通过内吞作用吸收外源DNA；②植物细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统可将胞外的外源DNA运输到系统的各个细胞中；③植物组织中的传递细胞膜透性的改变，可增加大分子物质（外源DNA）透过细胞膜进入受体细胞的机会。

生殖细胞浸泡法是植物遗传转化中最简便、快速、便宜的转化法。不需复杂的组织培养及昂贵的仪器，可同时处理大批量的受体材料，容易推广普及。但该方法重复性差，转化率较低，筛选和检测也比较困难，有待进一步完善。现在报道较多的in planta转化法，也是将受体植物浸泡转化，不过该方法较多采用处于开花期、去掉花序的整株植物作为受体，浸泡转化液也是含外源基因的根癌农杆菌菌液，一般不使用裸露的外源DNA溶液。

常用植物基因转化方法的特点比较见表9-2。