6.2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞
外源基因的导入是动物转基因技术的关键。尽管目前已建立起多种DNA的转化方法，有效地打破了动物细胞接纳外源DNA的化学壁垒，但受体细胞往往丧失了对转基因的控制能力。因此，发展和改进一些能使转基因维持其正确生物学功能的转化程序至关重要。
1.转基因的动物受体细胞系统
高等哺乳动物细胞的基因转化效率较低，欲获得足够数量的转化株，必须选择来源丰富的起始受体细胞，因此，在培养基中能无限制生长的哺乳动物细胞系通常用于基因转化实验。然而绝大多数动物组织的细胞在培养基中的生长具有平面接触抑制特性，只有来自肿瘤组织的永生性细胞系才能摆脱正常生长的限制。肿瘤细胞系不仅能在化学成分确定的培养基中无限制生长，而且生长速度较快，通常在不到一天的时间内增殖一倍。但是肿瘤细胞的生理特性有时与正常细胞并不相同，因此必须选择那些与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞系作为转基因的受体。
与细菌DNA转化原理相似，即便是在最佳转化条件下，能稳定接纳外源基因的转化株也只有动物受体细胞总数的千分之一。因此为了快速有效地筛选转化细胞，必须建立动物细胞特异性的选择标记。
哺乳动物细胞拥有两条不同的三磷酸脱氧核苷酸生物合成途径，即由5-磷酸核糖基-1-焦磷酸（PRPP）和尿嘧啶核苷一磷酸分别合成次黄嘌呤核苷一磷酸和胸腺嘧啶核苷一磷酸的重新合成途径，以及由次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷直接合成次黄嘌呤核苷一磷酸和胸腺嘧啶核苷一磷酸的补救途径。氨基蝶呤能同时抑制次黄嘌呤核苷生物合成的两步反应和胸腺嘧啶核苷生物合成的一步反应。如果在培养基中提供次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，细胞便可通过其补救途径免遭氨基蝶呤的抑制作用。胸腺嘧啶核苷生物合成补救途径中的关键酶是胸腺嘧啶核苷激酶（TK），携带该酶编码基因tk突变的细胞（tk-）不能在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培养基（HAT培养基）上生长，因此只有当用于转化的载体上含有tk基因，转化细胞才能正常生长。同理，对于含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt-），则可用hprt标记基因进行遗传互补。上述tk和hprt标记的使用要求受体细胞具有相应的突变性状，因而在应用范围上有所限制。更为理想的选择标记是直接为受体细胞提供显性遗传性状，其中最常用的当属细菌来源的新霉素抗性基因，其编码产物修饰、灭活能阻断哺乳动物细胞蛋白质生物合成途径的新霉素类药物G418。
2.重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
现在已建立多种可以将重组克隆载体DNA导入哺乳动物培养细胞的转染技术，其中最为常用的是磷酸钙共沉淀转染和DEAE-葡聚糖介导的转染，此外，还有利用polybrene（聚凝胺）的DNA转染、利用原生质体融合的DNA转染和电穿孔法DNA转染等。
无论采用何种方法将重组DNA导入细胞，转染效率在很大程度上取决于所用受体细胞的类型。不同的培养细胞系，其摄取和表达外源DNA的能力相差可达几个数量级。下面介绍重组DNA转染哺乳动物细胞的几种方法。
1）动物细胞物理转化法
利用物理方法转化动物细胞的主要优点是转基因不含任何病毒基因组片段，这对于基因治疗尤为安全。但转基因进入细胞后，往往多拷贝随机整合在染色体上，导致受体细胞基因灭活或转基因不表达。目前在动物转基因技术中常用的物理转化法包括以下几种。
（1）磷酸钙和DNA共沉淀物转染法：由磷酸钙介导的转染是最为常用的方法。重组DNA是通过内吞作用进入细胞质，然后进入细胞核而实现转染的。这种转染法十分有效，一次可有多达20％的培养细胞得到转染。由于重组载体以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现，培养细胞摄取DNA的能力将显著增强。在中性条件下形成磷酸钙-DNA共沉淀物的最佳Ca2+浓度为125 mmol/L，最佳DNA浓度为5～30μg/mL，沉淀反应的最佳时间为20～30 min，细胞在沉淀物中的最佳暴露时间为5～24 h。在转染后增加诸如甘油休克和氯喹处理等步骤，可以提高该法的效率。
（2）电穿孔DNA转染法：利用脉冲电场将DNA导入培养细胞的方法称为电穿孔DNA转染法，该法对于用其他转染技术不能奏效的细胞系仍可适用，已用于将重组DNA导入多种动物细胞和植物细胞，也用于细菌细胞。现有各种商品化的电穿孔装置，可按厂商提供的说明书进行操作。电穿孔DNA转染法的效率受以下因素的影响：外加电场的强度、电脉冲的长度、温度、DNA的构象和浓度，以及培养液的离子成分等。
（3）脂质体包埋法：将待转化的DNA溶液与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。当这种脂质体悬浮液加入细胞培养皿中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质和细胞核内。
（4）DNA显微注射法：该法的基本操作程序如下：通过激素疗法使雌性小鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌性小鼠，从其输卵管内取出受精卵；借助显微镜将纯化的转基因溶液迅速注入受精卵中变大的雄性原核内；将25～40个注射了转基因的受精卵移植到母鼠子宫中发育，继而繁殖转基因小鼠子代。转基因进入体内后随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变，但这种方法应用范围广，转基因长度可达数百kb。
2）化学物质介导转染法
（1）DEAE-葡聚糖介导转染法：该法可广泛用于转染带病毒序列的质粒。DEAE-葡聚糖这一聚合物可能与DNA结合从而抑制核酸酶的作用，或者与细胞结合从而促进DNA的内吞作用。该转染法通常只用于克隆目的基因的瞬时表达，它在BSC-1、CV-1和COS等细胞系表达行之有效。进行转染时所需DNA量较上法要少一些，所用DEAE-葡聚糖的浓度及细胞暴露于DNA/DEAE-葡聚糖混合液的时间是两个明显影响本方法效率的重要参数。可采用两种技术方案：较高浓度（1 mg/mL）和较短作用时间（0.5～1.5 h），或较低浓度（250μg/mL）和较长作用时间（8 h）。
（2）利用polybrene的DNA转染法：对于用其他方法相对较难转染的细胞系，可用聚阳离子polybrene来对小分子质粒DNA进行有效而稳定的转染，如用于CHO细胞时，可以获得约15倍于磷酸钙-DNA共沉淀法的转染细胞。
3）利用原生质体融合的DNA转染法
该法已用于克隆化目的基因的瞬时表达，也用于建立稳定转化的哺乳动物细胞系，其优点是转染效率较高。曾用此方法将免疫球蛋白基因稳定地引入B细胞，把珠蛋白基因导入小鼠红细胞白血病细胞，其过程如下：①用氯霉素扩增培养细胞中的重组质粒DNA，再用溶菌酶处理除去细胞壁制成原生质体；②通过离心使细菌原生质体覆盖于单层哺乳动物细胞之上，再用聚乙二醇（PEG）处理以促进两种细胞的融合（重组质粒DNA将转移至哺乳动物细胞中）；③除去PEG，用新鲜的组织培养液（含卡那霉素以抑制存活细菌的生长）培养细胞。
4）动物病毒转染法
通过病毒感染的方式将外源基因导入动物细胞是一种常用的转基因方法。根据动物受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转化载体。
（1）腺病毒：腺病毒科为线形双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93种，分为两个属：哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。目前已鉴定的人腺病毒有六个亚属，其中常用来构建载体的腺病毒主要是C亚属的2型病毒（Ad2）和5型病毒（Ad5）。腺病毒感染人体细胞是裂解型的，不会致癌，但对啮齿目动物细胞来说，绝大多数的腺病毒成员能致癌。
（2）猴肿瘤病毒：最早的动物病毒载体是以猴肿瘤病毒SV40 DNA为蓝本构建的。SV40为双链环状DNA病毒，全基因组共5226 bp，其中T/t基因的编码产物与病毒的致瘤作用密切相关，同时也是病毒生长周期中的重要调控因子，而晚期基因VP1～VP3则编码病毒颗粒的装配。首先将外源基因克隆在病毒-细菌杂合质粒上的SV40晚期基因启动子下游，然后从重组质粒上切下病毒和外源基因，并在体外自我环化。该环状分子与另一早期基因缺陷的辅助病毒DNA共同转染受体细胞，接纳了上述两种DNA分子的转化细胞便开始合成包装蛋白，并将经自主复制的两种DNA分子分别装配成具有感染力的辅助病毒和重组病毒颗粒。
（3）牛痘病毒：该病毒是大型DNA病毒，基因组约185 kb，能在宿主细胞质中自主复制。目前，广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒，其基因组上含有一个可表达的细菌T7RNA聚合酶基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后将含有外源基因和T7启动子的细菌重组质粒以脂质体的方式导入受体细胞。转化细胞经过一段时间培养后，外源基因即在T7RNA聚合酶的作用下转录并翻译出异源蛋白。人体囊状纤维化基因就是采用这种方法高效表达的。
（4）逆转录病毒：与上述裂解型的DNA病毒不同，逆转录病毒是一种整合型的单链RNA病毒。以逆转录病毒DNA为载体的转基因基本程序如下：首先构建含有选择性标记的逆转录病毒DNA与质粒的杂合型载体分子，然后将外源基因取代病毒的编码区域，并克隆在大肠杆菌中扩增鉴定；重组DNA分子通过物理方法转入一个特制的病毒包装工程细胞系（如小鼠细胞系），该细胞系在染色体的两个不同位点上分别整合病毒的5'-LTR-gag-3'-LTR和5'-LTR-pol-env-3'-LTR序列；进入上述包装细胞系的DNA转录出相应的重组RNA分子，与此同时细胞系合成包装蛋白，并将重组RNA分子包装成成熟的病毒颗粒；收集由包装细胞系分泌出来的重组逆转录病毒，进一步感染其他类型的动物受体细胞，重组RNA分子即可由DNA形式整合在染色体上，并表达外源基因。在构建转基因小鼠时，可将重组逆转录病毒感染八细胞阶段的小鼠胚胎细胞，利用标记基因筛选整合型转基因胚胎细胞，最终将之移植到小鼠子宫内发育。