5.5.3　mRNA差异显示技术

真核生物基因组中，仅10％～15％的基因在细胞中表达，而且不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中表达的基因也不尽相同。基因的差异表达不仅是细胞形态和功能多样性的根本原因，而且是各种生理及病变过程的物质基础，因此，分离、鉴定差异表达的基因具有重要的意义。根据高等生物成熟的mRNA都带有poly（A）的特性，用特定的锚定引物逆转录后，进行PCR扩增，建立mRNA差异显示技术，这种技术称为差异显示逆转录聚合酶链式反应（differential display of reverse transcriptional PCR，DDRT-PCR）技术。

1.DDRT-PCR技术的基本程序

mRNA差异显示技术是根据绝大多数真核生物细胞mRNA的3'端带有多聚腺苷酸尾（poly（A））的结构特点，以含Oligo（dT）的寡核苷酸为引物将不同的mRNA逆转录成cDNA。参照图5-17，该技术根据poly（A）序列起点前2个碱基除AA外只有12种组合可能性：5'-NMAAA… AA-3'，其中N代表A、G、C、T 中任意一种碱基，M代表G、C、T 中任意一种碱基。设计合成12种下游poly（dT）引物时，在其3'端加上两个锚定碱基引物：5'-TTT…TTTMN-3'，称3'端锚定引物，其通式为5'-T11 MN-3'；同时为扩增出poly（A）上游500 bp以内所有可能的mRNA序列，在5'端又设计了20种10 bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条带都代表一种特定mRNA类型，基本包括了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，即可显示不同的条带位置。将不同组织所特有的差别表达条带中DNA回收，扩增至所需含量，进行Southern印迹杂交、Northern印迹杂交或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，最终获得差异表达的目的基因。

图5-17　DDRT-PCR技术的基本程序

（引自吴乃虎，1998）
（a）分别从A组和B组提取总mRNA；（b）加入3'端锚定引物（5'-T11 MN-3'）进行逆转录合成第一链cDNA；（c）加入一对特定组合的5'端随机引物和3'端锚定引物（5'-T11 MN-3'），以及35 S-dNTP进行PCR扩增；（d）将同位素标记的PCR产物加样在变性的DNA序列胶中进行电泳分离，并做放射自显影，除了A组或B组特有的条带之外，大部分条带是两组共有的。

2.DDRT-PCR技术的优点

DDRT-PCR技术的优点可概括为“3SRV”（simplicity、sensitivity、speed、reproducibility、versatility），即：①简单，较易操作；②灵敏度高，PCR技术的应用使得低丰度mRNA的鉴定成为可能；③可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异；④实验周期短，约8d即可完成，便于重复；⑤可进行多基因家族的表达分析。

3.DDRT-PCR技术的缺点

尽管DDRT-PCR技术有以上诸多方面的优点，但在实际中仍存在一些问题，主要表现在：①出现差别条带太多，假阳性率高达70％左右，对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性；②扩增条带分子长度较短，一般在110～450 bp。