4.7.4　DNase Ⅰ足迹法

1.DNase Ⅰ足迹法的原理

DNaseⅠ足迹法是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及核苷酸序列结构的专门实验方法。它不仅能找到与DNA特异性结合的目的蛋白，而且能告知目的蛋白结合在哪些碱基部位。当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后，加入DNaseⅠ时该部位得到保护而免受DNaseⅠ酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，受到保护的DNA分子经酶切作用后遗留下该片段，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上出现了一个空白区，俗称为“足迹”（图4-21）。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单元的分布状况。

图4-21　DNase Ⅰ足迹法原理

2.DNase　Ⅰ足迹法实验流程

（1）将待检测的双链DNA分子在体外用32P做5'末端标记，通常只标记一端。

（2）在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可）混合，等两者结合后，加入适量的DNaseⅠ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设置未加蛋白质的对照，即实验组有DNA、蛋白质混合物，而对照组只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育。

①如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，经DNaseⅠ消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个、2个、3个核苷酸等一系列前后长度均相差1个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。

②如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护，免受DNaseⅠ酶的降解作用。

（3）从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中进行电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。

（4）结果判断：实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。