6.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法

6.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法

1.快速裂解菌落鉴定分子大小

这是在转化子初步筛选的基础上进一步对重组子进行筛选或鉴定的方法,主要是根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。

因为重组子中插入了外源DNA片段,相对分子质量较载体DNA分子的大,琼脂糖凝胶电泳时迁移速率慢,由此将重组子和非重组子区分开来,并最终筛选出重组子。此方法直观、快捷,只需获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳,尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。

2.限制性核酸内切酶酶解分析法

通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法虽可以初步筛选到重组子菌落,但难以将其中的期望重组子和非期望重组子区分开来,因为重组质粒DNA分子中,质粒载体可能与一个以上的外源DNA片段连接重组。而采用限制性核酸内切酶酶解分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子,而且能判断外源DNA片段的插入方向及相对分子质量大小等。其基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落快速提取质粒DNA,然后用限制性核酸内切酶酶解,并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。

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图6-7 空质粒和已连接目的基因的质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图

1:连接了目的基因的质粒;2:没有连接目的基因的空质粒;M:标准相对分子质量marker。

酶解方式主要有全酶解法和部分酶解法两种。

全酶解法的基本操作过程:用一种或两种能将外源DNA段从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解质粒DNA,凝胶电泳后重组质粒分子较单一载体质粒多出一条泳带,据此将重组子和非重组子分离开来(图6-7)。如果插入片段与载体质粒大小相近,则最好用合适的酶将之线形化,通过比较大小确定其是否为重组子。进一步利用在外源DNA片段上具有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切酶酶解重组质粒分子,根据酶切图谱分析即可判明插入片段的方向等。

部分酶解法则是通过一种或数种限制性核酸内切酶对重组质粒DNA分子进行部分酶解分析,根据部分酶解产生的限制性片段大小,确定限制性核酸内切酶识别位点的准确位置及各个片段的正确排列方式,从而将期望重组子筛选出来。部分酶解法较全酶解法简单易行,这两种方法通常用于当载体和外源DNA片段连接后产生的转化菌落比任何一组对照连接反应(如只有酶切后的载体或只有外源DNA片段)都明显多时的重组筛选。

3.利用PCR方法筛选确定重组子

在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多为固定已知的,如pGEM载体系列中多克隆位点两侧分别是SP6和T7启动子的序列。通过与插入位点两侧已知序列互补的引物,以从初选出来的阳性克隆中提取的少量质粒DNA为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落。PCR方法不但可迅速扩增插入片段,而且可直接用于DNA序列测定,目前已得到广泛的应用。