8.4　哺乳动物表达系统

哺乳动物表达系统包括瞬时表达系统（transient expression system）和稳定表达系统两类。两类系统的区别在于表达载体的不同。哺乳动物细胞系的表达载体有两类：一类是瞬时转染载体；另一类是稳定转染载体。瞬时转染载体所携带的外源DNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件以及某种蛋白质短时间起效的功能分析。稳定转染载体的外源DNA可以整合到宿主染色体中，而稳定存在于细胞中。外源DNA整合到染色体中的概率很低，所以通常需要通过一些选择性标记如潮霉素B磷酸转移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等基因反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。然而随着转染技术的革新，目前可以使用慢病毒转染，并加入特定的筛选标记（如嘌呤霉素），使得获得稳转细胞系的时间大幅缩短。

COS细胞（猴肾细胞）瞬时表达系统是目前应用最广泛的瞬时表达系统。其原因如下：首先，COS细胞容易获得，容易培养维护，容易转染；其次，大量的哺乳动物表达载体含有SV40病毒来源的DNA复制起始位点（SV40 ori），可以与COS细胞一起使用；第三，在转染的COS细胞中，含有SV40 ori的质粒被扩增到较高拷贝数，并产生高水平的mRNA转录本和它们编码的蛋白质产物。瞬时表达系统中的外源基因由于没有稳定地整合到宿主细胞染色体中，而是以染色体外的DNA形式存在，容易被细胞内的核酸酶降解，故外源基因不能长期稳定地表达，因此称为瞬时表达系统。COS细胞瞬时表达系统包含COS细胞系和带有SV40复制起始位点（SV40 ori）的表达质粒。在SV40病毒感染猴细胞后48 h，SV40 DNA可扩增1000拷贝，其原因是当SV40病毒的早期基因表达产物大T抗原与SV40 DNA的复制起始位点结合后，宿主细胞的DNA聚合酶就可以不断复制SV40 DNA。因此，SV40 DNA中由100 bp组成的SV40 ori可用于组建表达质粒。COS细胞是由非洲绿猴细胞系（CV-1）经过SV40 ori缺陷的SV40病毒基因组转化后形成的。COS细胞株的特点是能组成型表达SV40的大T抗原，但用于感染的SV40病毒有SV40 ori缺陷，因此SV40 DNA不能复制。当带有SV40 ori的质粒转染COS细胞系后，组成型合成的SV40大T抗原就可以启动质粒进行复制，使带有SV40 ori的质粒进行快速扩增。在转染COS细胞系后，每个细胞内带有SV40 ori的重组表达质粒将达到105个以上，质粒所携带的外源基因获得高效表达。由于转染质粒毫无节制地大量复制，最终超过细胞的承受极限而导致COS细胞死亡，因此这一系统的表达是瞬间性的。

要使外源基因在宿主细胞中高效、稳定地表达，必须建立起一个稳定的表达系统。表达载体的组建、基因的有效转染、基因的高效转录、有效的翻译起始、标记基因和目的基因的选择与共扩增、受体细胞的选择及培养条件的优化等都是建立稳定表达系统时必须考虑的因素。一般而言，目的基因的拷贝数越多，其基因产物的表达量越高，因此基因扩增为提高特定基因的表达水平提供了一个便利的方法。dhfr是最广泛应用的可扩增的选择标记基因，dhfr在细胞中的功能是催化二氢叶酸或叶酸还原成四氢叶酸。四氢叶酸是一种辅酶，是叶酸在体内的主要存在形式。叶酸类似物甲氨蝶呤（MTX）可抑制DHFR活性，使细胞致死。通过dhfr基因的扩增，某些细胞可以产生对MTX的抗性而存活。对MTX具高抗性的细胞内可有数千个dhfr基因拷贝，与其连接的外源基因拷贝数也大大增加，使其表达水平大幅度提高。

常用的CHO细胞一般是dhfr基因缺陷型的细胞，适用于多种蛋白质的分泌表达和胞内表达，培养条件简单，适合于规模化生产。同COS细胞瞬时表达系统不同，要想得到长久稳定表达的细胞系，必须施加选择压力使外源基因进行扩增并且使其和启动子（如SV40启动子、CMV启动子）整合到宿主基因组DNA上，并与膨胀的染色体均匀着色区（homogenously staining region，HSR）相连。在无选择压力的情况下，扩增的基因也可能不稳定而最终丢失。由dhfr基因扩增形成染色体外的“双微染色体”（double-minute chromosome，DMS），虽然可以自我复制，但由于缺乏着丝粒，因此在有丝分裂时不能均匀分配，当选择压力消除后，它们即会迅速消失。