7.3.4　提高表达蛋白的稳定性，防止其降解

外源蛋白表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶降解，这是基因高效表达的一个重要参数。蛋白酶水解是一个具有高度选择性的、严格调节的过程，该过程参与许多代谢活动。在宿主细胞中含有许多蛋白酶，这些蛋白酶参与宿主的代谢活动，如选择性地清除异常和错误折叠的蛋白质。到目前为止，蛋白酶解的机制尚未完全明确，但已有一些策略和方法以减少宿主中异源蛋白的降解。

1.蛋白质降解机制

虽然使得蛋白质不稳定的精确结构特点还不清楚，但是通过系统研究已经明确了一些蛋白质不稳定的决定因素。①蛋白酶解途径的“N末端规则”在大肠杆菌中能够发挥作用，即蛋白质的稳定性与其氨基端的残基有关。在大肠杆菌中，N末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为2 min，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10 h。有研究表明，在多肽的第二位带有较小侧链的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N末端甲硫氨酸的去除，从而暴露出位于第二位的亮氨酸，使得该蛋白质不稳定。②泛素依赖性蛋白质降解。位于蛋白质中特异性的内源赖氨酸残基是泛素的修饰位点，当泛素结合到蛋白质链上，有利于泛素蛋白依赖的蛋白酶对蛋白质的降解。③PEST假说。根据对短寿命真核蛋白的统计分析，蛋白质如果有富含Pro、Glu、Ser和Thr的区域，且在该区域附近有某些特定的氨基酸，则该蛋白质就会不稳定。这些PEST结构域的磷酸化导致钙的结合能力提高，从而有利于钙依赖性蛋白酶对蛋白质的降解。这说明可以在缺乏PEST蛋白裂解系统的E.coli中表达PEST富含蛋白。

2.减少重组蛋白裂解的策略

在产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：①产生可分泌的蛋白质，将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中。②选择合适的表达系统。选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌，使表达的外源蛋白不被降解。③对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造，使外源蛋白不能被蛋白水解酶识别。④构建融合基因，产生融合蛋白。融合蛋白通过构象的改变和空间的保护，使外源蛋白不被选择性降解。如在大肠杆菌中，可通过构建融合基因表达融合蛋白，提高目的蛋白的活性，减少无活性包含体的形成。⑤在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子，如与分子伴侣或T4噬菌体pin基因共表达。