5.1.3　人工合成基因

目的基因的化学合成实质上是双链DNA的合成。目前，化学合成寡核苷酸片段的长度一般限于150～200 bp，而绝大多数基因的长度都超出这个范围。对于60～80 bp的短小目的基因或DNA片段，可以分别直接合成其两条互补链，然后退火，而合成300 bp以上的长目的基因，则必须采用特殊的战略，因为一次合成的DNA单链越长，收率越低，甚至根本无法得到最终产物。大片段目的基因的合成通常采用单链小片段DNA模块拼接的方式，主要有以下三种方法。

1.小片段黏接法

将待合成的目的基因分成若干小片段，每段长12～15 bp，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段，然后化学合成，退火后形成双链DNA大片段。若一个目的基因500 bp长，则每条链各由30～40个不同序列的寡核苷酸组成，总计合成60～80种小片段产物，将之等分子混合退火，由于互补序列的存在，各DNA片段会自动排序，最后用T4 DNA连接酶连接切口处的磷酸二酯键（图5-2）。这种方法的优点是化学合成的DNA片段小，收率较高。但各段的互补序列较短，容易在退火时发生错配，造成DNA序列的混乱。

图5-2　小片段黏接法

（引自张惠展，2010）

2.补丁延长法

将目的基因的一条链分成若干40～50 bp的片段，而另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片段，约20 bp长。两组不同大小的DNA单链片段退火后，用Klenow DNA聚合酶将空缺部分补齐，最后用T4 DNA连接酶连接切口处的磷酸二酯键（图5-3）。这种化学合成与酶促合成相结合的方法可以减少寡核苷酸的合成工作量，同时又能保证互补序列有足够的长度，是目的基因化学合成中常采用的战略。

图5-3　补丁延长法

（引自张惠展，2010）

3.大片段酶促法

将目的基因两条链均分成40～50 bp的单链DNA片段，分别进行化学合成，然后用Klenow DNA聚合酶补平，最后用T4 DNA连接酶连接切口处的磷酸二酯键（图5-4）。这种方法虽然需要合成大片段的DNA单链，但拼接模块数大幅度减少，较适用于较大目的基因的合成。

图5-4　大片段酶促法

（引自张惠展，2010）

在化学合成目的基因前，除了按上述三种方法对模块大小及序列进行设计外，通常在每条链两端的模块中额外加上合适的限制酶切位点序列，这样合成好的双链DNA片段只需要用相应的限制性核酸内切酶处理即可方便地克隆到载体分子中。