6.3.8 电子显微镜作图检测法
在一定条件下,DNA分子中某些特殊的区段,如AT丰富区段、不同DNA分子的同源区段及与RNA分子同源的DNA区段等,能呈现出特殊的结构,利用电子显微镜进行观察作图,可以鉴定这些结构,并用于克隆基因的定位研究等。
1.R环检测法
R环检测法是一种采用mRNA做探针,用于检测具有外源DNA插入片段重组体分子的核酸杂交法。其原理如下:在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70%)的甲酰胺溶液中,双链的DNA-RNA杂交分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此,将RNA及变性DNA的混合物置于这种退火条件下,RNA便会同它的双链DNA分子中的互补序列退火,形成稳定的DNA-RNA杂交分子,而使被取代的另一链处于单链状态。
这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的泡状体,称为R环结构。R环结构一旦形成就十分稳定,而且可以在电子显微镜下观察到。因此,应用R环检测法可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。
根据这样的原理,在有利于形成R环的条件下,使待检测的纯化的质粒DNA在含有mRNA分子的缓冲液中局部地变性。如果质粒DNA分子上存在与mRNA探针互补的序列,那么这种mRNA将取代DNA分子中相应的互补链,形成R环结构。然后置于电子显微镜下观察,便可检测出重组体质粒DNA分子。
2.变性作图
变性作图(denaturation mapping)一般用于DNA分子中AT丰富区段的鉴定。将DNA分子暴露在变性条件下,AT丰富区端因融解温度较低最先发生变性解链,形成部分变性的DNA分子,在高浓度的甲酰胺溶液的稳定作用下,利用电子显微镜可以观察到这些变性区段形成的特殊“泡”状精细结构,以此作为标记位点,可用于克隆基因的定位。
3.异源双链定位法
如果两条单链DNA分子间有一定的同源序列,在复性条件下,两条单链DNA分子在同源序列处可因碱基配对而结合,形成部分双链结构。据此,将经碱变性处理的两种DNA分子混合,溶液调至中性后加入甲酰胺,使DNA分子复性。当同源序列有50%复性杂交后,将混合溶液稀释,在电子显微镜下观察并作图,可以获得异源双链间同源序列及非同源区序列的有关信息。如果使用探针和待测DNA分子进行上述操作,很显然,可以在待测DNA分子上定位与探针序列有同源性的区段。