12.4.4 基因转移技术

12.4.4 基因转移技术

基因转移技术根据基因转移途径可分为两类:一是ex vivo(体外),即将构建的含有目的基因的载体在体外导入靶细胞,经过体外增殖、筛选、药物处理或其他操作后,再输回患者体内;二是in vivo(活体内),即将无复制能力的、含外源目的基因的重组病毒载体直接应用于患者体内,此外还包括将脂质体包埋或裸露DNA直接注射到患者体内等方法。ex vivo法尽管比较经典且安全,同时治疗效果易于控制,但因其操作步骤多,技术较复杂而不易推广;相比于ex vivo法,in vivo法则操作简便,虽然该方法目前尚不成熟,还存在疗效短暂、免疫排斥及安全性等问题,但仍是基因转移方法的重点研究方向。

基因治疗近年来取得突破性进展,关键在于基因转移技术的不断发展。近年发展起来的基因转移技术已有十余种。基因治疗按所选载体的不同一般分为两类:一类为病毒介导的基因转移系统(生物学方法);另一类为非病毒介导的基因转移系统(非生物学方法)。

1.病毒介导的基因转移

病毒提供了将外源基因导入细胞的有效方法。RNA和DNA病毒均曾经用作基因转移的载体。但是,自然情况下大多数病毒对机体具有致病性,因此必须对病毒进行改造后才能用于人体。

2.非病毒基因转移

在基因治疗试验中所应用的非病毒基因转移法有物理法(直接注射法)、化学法(磷酸钙共沉淀法和脂质体转染法)和生物化学法(配体-DNA结合物和腺病毒-配体-DNA结合物)。这些基因转移的方法可以转移DNA载体,能将大分子物质导入哺乳动物细胞中,并在细胞内运输。因为外源性治疗基因在细胞内受正常机制的降解而从细胞中排除,所以由这些方法转移的基因的表达往往是暂时性的。理论上讲,非病毒基因转移要比重组病毒转移更安全。但是,在靶细胞内稳定整合外源基因也可能引起不良后果,只是这方面的研究还不多。

1)直接注射法

将含有DNA的溶液(或DNA沉淀物)直接注射入器官(如肌肉或甲状腺等),邻近注射位点的细胞即可摄入DNA,并且对这些基因进行表达。有研究表明,这种作用在甲状腺中能持续3~5 d。在肌肉中基因表达则可持续数月之久。

2)磷酸钙共沉淀法

磷酸钙共沉淀法的大体过程是,将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液(PBS)在一起缓慢混合时,形成磷酸钙微细沉淀;形成的DNA-磷酸钙沉淀物能附着在细胞上,并经过细胞内吞作用而进入细胞质中。这种基因转移方法的主要优点是简单性和普遍性。其主要的缺点是转化率通常很低,需要用一个很强的选择性标记基因进行筛选。

3)脂质体转染法

脂质体是一种被广泛应用于体内或体外运载外源性遗传物质进入细胞的载体。脂质体可以用于用其他方法不能进行基因转移的细胞。脂质体介导的基因转移的最大优势就在于能够应用于活体,且转移的效率较高。第一个使用非病毒基因转移法的临床试验就是用脂质体进行包裹的。

4)受体介导的基因转移

受体介导的基因转移方法是近年来建立的非病毒基因转移技术,它利用受体介导的细胞内吞作用转移外源基因。该方法是将质粒DNA和某种特异的多肽(配体)形成复合物,其中多肽成分能被细胞表面的受体识别。这是一种具有特异靶向性的转移方法,能使外源基因在活体内导向特异类别的细胞。然而,转移基因时所形成的内吞小泡通常要被送到溶酶体中,而在溶酶体中这种内吞小泡的内容物将被降解。