8.4.3 哺乳动物基因表达宿主细胞
哺乳动物表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、HEK293、BHK、N1H3T3等，其中CHO细胞是近年来研究最多、应用相对成熟的宿主细胞系，已经用于多种外源蛋白的表达。另外，犬肾细胞系（MDCK）、非洲绿猴肾的Vero细胞系等常在生产流感疫苗时使用，但是这些细胞系的糖基化作用也不尽相同。
目前用于基因工程的几种哺乳动物基因表达宿主细胞主要特点如下。
（1）BHK-21细胞：最早建立BHK-21细胞系的是英国Glasgow大学的Macpherson等，1961年他们从5只生长1d的地鼠幼鼠的肾脏中分离出该细胞。现在广泛使用的BHK-21细胞是从单细胞经过13次克隆后建立起来的细胞株。原始的BHK-21细胞株是成纤维样细胞，核型为2n=44，具有贴壁依赖性，但经过反复传代后，BHK-21细胞也可悬浮培养。通常用的培养基为DMEM培养基，添加7％胎牛血清。该细胞既可用于增殖病毒制作疫苗，也可用于生产重组蛋白，如重组凝血因子Ⅷ已获批用于临床治疗甲型血友病。
（2）C127细胞：该细胞是从RⅢ小鼠乳腺肿瘤中分离出来的一株细胞，由牛乳头瘤病毒（bovine papilloma virus，BPV）构建的载体BPV-1对C127细胞的转染效果较好。BPV-1病毒载体的优点是转染后可以引起细胞形态发生明显变化，容易识别被转染的C127细胞。基于该技术的C127细胞/BPV-1表达系统已经用于生产重组人生长激素（human growth hormone，hGH），并获准用于临床治疗缺乏生长激素的疾病。促红细胞生成素（EPO）在C127细胞/BPV-1表达系统中也获得高水平表达，其浓度可达到10 mg/L。
（3）CHO-K1细胞：美国Colorado医学院的Puck等在1957年从成年中国仓鼠卵巢的活检组织获得CHO细胞，CHO-K1是CHO的一个亚型，其细胞形态为上皮样，是一株二氢叶酸还原酶的缺陷型细胞。通过甲氨蝶呤使外源基因拷贝数扩增，提高外源蛋白表达水平。目前广泛应用的工程细胞是CHO-dhfr-，它在甲氨蝶呤选择压力下可使外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10 μg/mL以上。它的培养基可用DMEM加0.1 mmol/L次黄嘌呤和0.01 mmol/L胸苷，以及10％小牛血清，也可在无血清培养基上生长，适合大规模培养。目前CHO-K1细胞已用于生产组织型纤维酶原激活剂（t-PA）、β干扰素、γ干扰素、促红细胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原疫苗（HbsAg vaccine）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、凝血因子Ⅷ和DNA酶Ⅰ等。
（4）COS细胞：该细胞是由Gluzman在1981年用无复制起点的SV40 DNA转化非洲绿猴肾细胞CV-1后获得的，包括COS-1、COS-3和COS-7三个细胞系，和非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、著名的HeLa细胞系一样是常用的细胞系。COS细胞可以与带有SV40复制起始位点（SV40 ori）的表达质粒组成瞬时表达系统。SV40复制子的快速复制特征，使COS细胞因无法忍受如此大量的染色体外DNA复制而死亡。COS细胞瞬时表达系统有广泛的应用前景，由于COS细胞来源广，易培养和转染，加上带有SV40 ori的表达质粒在COS细胞中的高拷贝数，使外源基因高水平表达mRNA和蛋白质，可以作为对组建的真核基因表达载体的快速评估系统。
（5）MDCK细胞：1958年Madin和Darby从西班牙长耳成年雌狗肾脏中分离出该细胞，它是一种上皮样细胞，具有贴壁生长的特征，可在微载体上进行增殖。该细胞能用于培养多种病毒，已被用于生产兽用疫苗。最近研究者用带有人巨细胞病毒早期启动子的载体转染MDCK细胞，高效表达MMP13金属蛋白酶，表达量占细胞分泌蛋白总量的15％～20％，浓度高达10 mg/L。
（6）MRC-5细胞：该细胞源于英国国立医学研究所的Jacobs等在1966年从14周的正常男性胎肺组织中获得的一株二倍体成纤维细胞，其核型为2n=46。可以用BME培养基加10％小牛血清进行培养，但只能传代培养42～46代。具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）B型同工酶标记。与WI-38细胞相比，其细胞分裂周期较短，因此增殖速率较快，但对不良环境因素的敏感性较WI-38细胞低。多种人类病毒都可侵染MRC-5细胞进行增殖，因此该细胞已经被广泛用于生产人用疫苗。
（7）Namalwa细胞：该细胞最早由Singh于1972年从名为“Namalwa”的肯尼亚Burkitt淋巴瘤患者中分离获得，后在瑞典Karolinska研究所建成一株人的类淋巴母细胞。多数Namalwa细胞缺少Y染色体，只有一条X染色体，标记染色体有12～14条，有2.8％的细胞是高倍体。虽然Namalwa细胞的基因组中含有部分EB病毒基因，但不会产生有活性的EB病毒粒子，因此Namalwa细胞的安全性有保证。该细胞已被用于大规模生产α干扰素，也可用于生产其他生物制品。Namalwa细胞已经用于生产人重组EPO、人重组淋巴毒素、G-CSF、α干扰素、β干扰素、t-PA和pro-UK等。Yanagi等认为，外源基因之所以在Namalwa细胞中的表达水平较高，可能因为该细胞是已经分化成熟的B淋巴细胞，具有大量分泌免疫球蛋白的特征。通常用RPMI1640加7％胎牛血清来培养Namalwa细胞，也可用无血清培养基在悬浮状态下高密度培养该细胞，并有效表达外源基因。
（8）Vero细胞：1962年日本Chiba大学的Yasumura等从正常的成年非洲绿猴肾中分离到一株贴壁生长的成纤维细胞，命名为Vero细胞。核型为2n=60，1.7％的细胞为高倍体，可持续培养。Vero细胞常用199培养基加5％胎牛血清来培养。使用不同的启动子在该细胞中表达HbsAg，其表达量也表现出差异。用人金属硫蛋白启动子比SV40启动子的表达效率要高很多。Vero细胞可支持多种病毒的增殖并制成疫苗，目前脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗和乙脑疫苗已经投放市场。2020年12月，由我国国家药品监督管理局附条件批准国药集团中国生物北京生物制品研究所有限责任公司的新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）注册申请。
（9）WI-38细胞：1961年美国的Hayflick等从高加索女性的正常胚胎组织中获得成纤维样的WI-38细胞系，核型为2n=46。该细胞可用BME培养基加10％小牛血清进行培养。每24 h细胞分裂一次，最多可传代培养50代。该细胞是最早被认为安全的传代细胞，20世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（10）鼠骨髓细胞：该宿主细胞是专门的分泌细胞，其培养基上清液中的Ig可达到100 mg/L，容易转染和培养，可在无血清培养基中进行高密度培养；具有蛋白质糖基化的修饰能力；可以通过载体的增强子和启动子设计达到高效表达外源基因的目的。目前使用的骨髓瘤细胞有Sp2/0、J558L和NS0等。
（11）SP2/0-Ag14细胞：1978年瑞士的Shulman和英国的Wilde等用BALB/c小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合形成杂交瘤SP2/HL-Ag，从亚克隆中分离获得SP2/0-Ag14细胞。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受20 μg/mL8-氮鸟嘌呤，但在含HAT选择培养基中不能存活。该细胞通常用DMEM培养基添加10％胎牛血清来培养。该细胞系已被广泛地用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。近年来SP2/0-Ag14细胞作为高表达宿主细胞用于生产其他药品，包括t-PA和pro-UK。由该细胞表达的pro-UK在治疗心肌梗死方面取得了很好的疗效。