2.3.3　T4DNA聚合酶

T4 DNA聚合酶（T4 DNA polymerase），来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，由噬菌体基因43编码，相对分子质量为114000。它与Klenow DNA聚合酶一样，具有5'→3'的聚合酶活性和3'→5的外切酶活性，但T4 DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比Klenow DNA聚合酶高200倍，且3'→5'的外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA更强。

此外，T4 DNA聚合酶有第三种活性——取代合成。在没有dNTPs存在的条件下，3'→5'外切酶活性成为T4 DNA聚合酶的独特功能。当反应混合物中只有一种dNTP时，这种外切酶活性将从dsDNA的3'-OH末端开始降解，直至进行到同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸出现时为止，最终产生出具有一定长度的3'隐蔽末端。当反应混合物中加入足够的四种dNTPs时，具有一定长度3'隐蔽末端DNA片段便起到引物模板的作用，其聚合作用的速率超过外切作用的速率，表现出DNA净合成反应。如果反应物中加入标记的脱氧核苷三磷酸（α-32P-dNTPs），通过T4 DNA聚合作用，反应物中的α-32P-dNTP逐渐地取代了被外切酶活性降解掉的DNA片段上的原有的核苷酸，因此，这种反应称为取代合成。应用取代合成法可以给平末端或具有3'隐蔽末端的DNA片段做末端标记。

T4 DNA聚合酶催化的取代合成法制备的高比活性的DNA杂交探针，与用切口平移法制备的探针相比具有两个明显的优点：第一，不会出现人为的发夹结构（用切口平移法制备的DNA探针则会出现这种结构）；第二，应用适宜的限制性核酸内切酶切割，它们便可很容易地转变成特定序列的（链特异的）探针。

T4 DNA聚合酶在基因工程中的用途主要有：①以填充反应补平或标记限制性核酸内切酶消化DNA后产生的3'隐蔽末端；②以取代反应对带有3'突出末端或平末端的双链DNA分子进行末端标记；③借助其3'→5'外切酶活性，以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针。