3.4　柯斯质粒载体

柯斯质粒（cosmid），英文名字由“cos site-carrying plasmid”缩写而来，即带有λ DNA cos位点和质粒复制元件的人工质粒载体。cosmid综合了质粒和λ噬菌体载体的优点，在具有质粒操作便利性的同时，还具有λ噬菌体载体的转染高效性、高承载量的特点。λ噬菌体载体的理论最大承载量为23 kb，在实际操作过程中其承载量为15 kb左右。因此，当使用λ噬菌体载体克隆真核生物基因组DNA时，由于真核生物内含子的缘故，有时15 kb的承载量不能容纳完整的基因，所以就需要一种更高承载量的克隆载体，而cosmid的出现满足了这样的要求。

cosmid是由λ DNA和质粒DNA进行重组构建而成，其内部保留了λDNA的cos位点和质粒的复制元件和选择性标记。通常cosmid大小为6 kb左右，其中包括1.7 kb λ DNA cos位点及周围序列和约4 kb的质粒DNA序列，因此，其允许外源DNA的插入长度为30～45 kb。载体的大量制备及外源DNA的插入操作过程和质粒完全相同，可以以质粒形式转化细胞，利用其内部的抗性基因进行转化子筛选。当外源DNA插入cosmid后，cos位点可以用来进行噬菌体颗粒包装。λDNA包装过程只需要识别DNA两端的cos位点，而与DNA内部序列无关，因此，cos位点为cosmid的组装提供了包装信号，利用λDNA的体外包装系统包装成具有感染性的噬菌体颗粒。在此过程中，非重组体由于长度过短不能满足λDNA的包装条件，不能包装成有感染性的噬菌体颗粒，所以cosmid无须进行重组体筛选。包装后的cosmid以噬菌体相同的转染效率将外源DNA带入宿主细胞，且由于cosmid内部不带有λ DNA的增殖调控和组装元件的编码基因，因此摆脱了λ噬菌体的增殖途径，而以质粒的形式在细胞内复制增殖。其在宿主细胞内的拷贝数由质粒的性状决定，增殖产物以提取质粒的方式从细胞中分离纯化。

常用的cosmid包括pHC79、pJB8、pU206和pLFR-5等。其中pHC79（图3-24）是由λDNA片段和pBR322质粒重组而成。pHC79包含λDNA cos位点和包装相关序列，包含pBR322质粒的复制起点和Ampr和Tetr两个抗性基因，长度为6.1 kb，允许插入外源DNA的范围为31～45 kb，可以包装成具有感染性的噬菌体颗粒。

图3-24　柯斯质粒pHC79载体结构