4.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis),是以单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)聚合而成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。凝胶聚合催化常用的方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合法以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时N,N'-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。其分离原理与琼脂糖凝胶电泳相同,除了具有电荷效应外,同样具有分子筛效应。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型
聚丙烯酰胺凝胶电泳主要有非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)两大类。在Native-PAGE时,蛋白质能够保持完整状态,并依据其相对分子质量大小、形状及所带的净电荷量而逐渐呈梯度分开。在SDS-PAGE时,向样品加入还原剂和过量SDS,使蛋白质变性解聚,并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物,掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异,使各种蛋白质的电荷/质量值都相同,因而在电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。前者主要用于核酸分析,后者主要用于蛋白质相对分子质量测定等。依据凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分是否一致,又可将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统和不连续系统两大类。前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH值和凝胶孔径相同,后者除了电泳槽中的缓冲体系和pH值与凝胶中不同外,凝胶本身也由缓冲体系pH值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成,因此凝胶不仅有分子筛效应,还具有浓缩效应。由于凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH值和电位梯度的不连续性,蛋白质分子在浓缩胶和分离胶的界面处浓缩成一条狭小的缝带,即能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层,从而提高电泳分辨率。尤其对小DNA片段的分析(5~500 bp),在这一范围内,仅差1 bp的DNA分子也能清晰地分开(表4-2)。
表4-2 聚丙烯酰胺凝胶浓度与DNA分子有效分离范围
