5.4.3　cDNA文库的改良

5.4.3　cDNA文库的改良

1.均一化cDNA文库

cDNA文库的均一化，是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含于其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上的巨大差异给文库筛选和分析带来的障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。构建均一化cDNA文库主要有两种方法。

1）基因组DNA饱和杂交法

在mRNA水平上，基因之间丰度差异极大；在基因组水平上，基因之间拷贝数差异不大，即基因在基因组上具有拷贝数相对一致的性质。通过cDNA与基因组DNA饱和杂交降低高丰度mRNA在文库中高拷贝数存在的cDNA的丰度。将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃去未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放已均一化后的总cDNA，转化宿主。此法优点是简单、易于掌握，缺点是部分基因cDNA的丢失，因为低拷贝数的表达基因因拷贝数低而未杂交。

2）二级复性动力学处理

二级复性动力学是指高丰度的cDNA在退火条件下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，可以通过控制复性时间来降低丰度。用羟基磷灰石柱将单链cDNA和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。此法优点是基因丢失较少、均一化效果好，缺点是技术要求比较高，操作难度大，需要多次摸索才能找到最适条件。

均一化cDNA文库具有以下四方面的优点：第一，可以节约大量研究成本；第二，增加克隆低丰度mRNA基因的机会；第三，与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库进行杂交，可以估计出大多数基因的表达水平并发现一些组织特异的基因；第四，可以用于遗传图谱的制作和大规模的原位杂交，还可以用于大规模测序或芯片制作等研究。

2.全长cDNA文库

mRNA的降解、DNA聚合酶和RNase H活性的改变，以及mRNA模板的脱离等都可能导致cDNA不完整。保持mRNA的完整性是构建全长cDNA文库的核心。mRNA完整性可通过直接检测mRNA分子的大小或测定mRNA的转译能力来确定。

1）SMART法构建全长cDNA文库

采用Clontech公司的专利试剂盒，其独特的逆转录酶具有末端转移酶活性，逆转录酶自动在逆转录得到的cDNA第一链的3'末端加上Oligo（dC），利用具Oligo（dG）的接头引导第二链的合成。

SMART法主要利用Power Script逆转录酶和内切酶Sfi Ⅰ的特性，快速、简单地构建全长cDNA文库（图5-11）。Power Script逆转录酶还具有末端转移酶活性，能够长距离地逆转录，当逆转录到mRNA 5'帽子结构时，能在相应的核酸3'端补上一段Oligo（dC），而对于非全长cDNA，因逆转录没有延伸到mRNA 5'端而不能在其3'端加上Oligo（dC）。用于合成cDNA第二链的引物只能结合3'端含Oligo（dC）的全长cDNA，不能与短片段cDNA结合，因而最终得到的是全长的cDNA双链。实验在引物5'端引入了SfiⅠ识别位点，使合成的全长cDNA两端含有SfiⅠ识别位点，经过SfiⅠ单酶切，可以实现目的基因的高效、定向克隆。

2）Cap-trapper法构建全长cDNA文库

在mRNA的两端均打上生物素标记，合成cDNA第一链时用dm5 CTP代替dCTP（可以保护cDNA，使其不被随后的限制性核酸内切酶消化），用RNase A消化单链RNA。

1996年，Carninci等建立了Cap-trapper法，主要利用mRNA分子经氧化后可与生物素结合而被标记的原理（图5-12）。在cDNA第一链合成时，生物素标签结合到RNA-DNA杂合体上；经RNase A消化，所有RNA分子3'末端的生物素标签被去除，与不完全cDNA互补的mRNA 5'末端的生物素标签被降解，而全长cDNA 5'端的生物素标签被保护而未被降解；这些全长cDNA被免疫磁珠吸附而富集，开始合成第二链。该方法还得到改进，如用海藻糖、山梨糖醇热启动逆转录反应，有利于全长cDNA的合成；用对甲基化敏感的限制性核酸内切酶Sth（或Bsa Ⅰ、Bam H Ⅰ/Xho Ⅰ）替换Ecol Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切，提高了文库中全长cDNA的比例；再就是用SSLM法加尾，可减少Oligo（dG）加尾的干扰，有利于全长cDNA的转录和表达克隆。

3）烟草酸性焦磷酸酶法构建全长cDNA文库

该方法根据完整的mRNA分子含有5'端帽子结构，而部分降解的mRNA分子则没有此结构的特点构建全长cDNA文库（图5-13）。采用Invitrogen公司试剂盒，利用细菌碱性磷酸酶（BAP）处理去除mRNA　5'端磷酸基团。用烟草酸性焦磷酸酶（tobacco acid pyrophosphatase，TAP）处理以移去mRNA的帽子结构，产生5'端磷酸基团，利用T4RNA连接酶（可催化单链DNA或RNA形成共价键）为脱帽后mRNA的5'末端接上人工接头，利用Oligo（dT）的人工接头进行逆转录，得到的全长cDNA第一链的两端就有特别设计的人工接头，用PCR对全长总cDNA进行放大，酶切后与载体连接。