3.6.2　腺相关病毒

3.6.2　腺相关病毒

1965年首次发现腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），它起源于细小病毒（parvovirus）家族的依赖病毒属病毒，作为共同感染病毒和腺病毒共同感染患者。这种小型病毒是一种天然的复制缺陷型病毒，需要腺病毒或疱疹病毒（herpes）作为辅助病毒，在其帮助下才能够在宿主细胞中增殖。

1.AAV结构

（1）衣壳：AAV无被膜结构，外部为直径22 nm、呈二十面体结构的外壳。AAV每种不同的血清型都具有自己特殊的衣壳结构，这些不同的衣壳结构对不同细胞受体亲和力不同，这种特征使AAV可以特异性针对不同组织细胞。

（2）基因组：AAV基因组为线状单链结构，内部含有两个开放阅读框（ORF），两端含有145 bp的末端重复序列（ITR）。5'端ORF编码四种重要的与复制相关的蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，3'端ORF编码三种衣壳蛋白。

2.生命周期

在AVV载体中，2型血清型AAV是在临床基因治疗试验中应用最为广泛的病毒。2型血清型AAV首先通过带有负电荷的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）结构与宿主细胞相结合。位于宿主细胞膜表面的整联蛋白和不同生长因子的复合受体可以增强病毒与宿主细胞的相互作用。宿主细胞通过内含蛋白介导的内吞作用将载体摄入细胞。内吞小体的迅速酸化使得病毒基因组被释放出来。目前，病毒基因组与宿主细胞基因组的整合过程仍不清楚，但研究人员发现，在AAV基因组复制之前，需要辅助病毒增加宿主细胞核膜的通透性。AAV基因组一旦进入细胞核，病毒DNA会整合到19号染色体的S1位点，并开始转录和复制，产生四种Rep蛋白和三种衣壳蛋白（表3-3）。

在构建AAV载体和外源DNA的重组体时，需删除Rep和Cap的编码基因，这使外源DNA的承载能力大约达到5 kb，因此重组体只含有天然病毒的ITR区段。ITR区段作为顺式作用元件发挥作用，在辅助病毒的帮助下可以为重组体提供复制和包装信号。Rep和Cap蛋白以及其他辅助腺病毒基因可以在质粒上表达。这种质粒表达策略可以避免使用野生型腺病毒共感染细胞，更加安全。生产AAV载体时需要将去除Rep和Cap编码区域的AAV DNA和辅助质粒共转染人胚肾HEK293细胞系。

3.基因治疗应用研究

AAV载体的优点使其主要被广泛用于组织工程研究，但它也有缺点，有待克服。AVV载体的优点和缺点见表3-4。

在动物模型研究中，AAV已经被用于皮肤烧伤、切除型创口和切开型创口损伤的治疗研究，并展示出良好的应用前景。由于AAV不同血清型的衣壳结构不同，因此AAV载体可以感染多种不同的组织。研究人员发现AAV载体可以感染脑组织、肌肉组织、视网膜等多种组织的细胞，并在这些细胞中具有很好的稳定性。例如，最为常用的2型血清型AAV（AAV2）对HSPGs受体具有很高的亲和力，多种类型的细胞都含有这种受体；而5型血清型AAV（AAV5）可以结合血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR），脑组织、肺组织和视网膜组织都含有PDGFR。其他血清型的AAV的受体虽然不是非常明确，但研究表明它们对多种细胞具有特异性亲和能力。例如，AAV1可以特异性感染肌肉组织，AAV6可以特异性感染肺组织，AAV7可以特异性感染肌肉和肝脏组织，AAV8可以特异性感染肝脏组织。深入研究表明嵌合血清型AAV载体，即两种不同血清型的AAV的重组病毒载体，对两种初始病毒的受体都有亲和力。无论在人源细胞和非人源细胞，这种重组AAV载体一旦进入细胞，大部分载体以非整合状态存在，然而在脑、肌肉和视网膜等组织中，这种杂合状态AAV载体外源基因的稳定表达时间可以超过一年。

AAV载体不同于其他基因治疗载体，其研究主要集中在由单基因紊乱诱发的遗传疾病（53％），其次是癌症（23％）。例如，囊肿性纤维化（cystic fibrosis）是最常见的利用AAV载体进行治疗性研究的遗传疾病。也有研究将AAV载体用于B型血友病（hemophilia B）治疗研究，并获得成功。虽然在研究领域获得了很多令人鼓舞的结果，但距离应用于临床治疗还有一段距离。此外，重组AAV载体在Canavan病（海绵状脑白质营养不良）、婴儿期神经元蜡样沉积症、帕金森病和α1-抗胰蛋白酶缺乏症等遗传疾病的治疗研究领域也有较好的应用前景。