7.3.1 优化表达载体的设计
如何使外源基因在宿主细胞中高效表达是基因工程的关键问题。其中表达载体的主要作用，不仅表现在能在宿主细胞中稳定地存在，还包括能使外源基因在宿主细胞中大量地表达。不同的载体具有不同的特点，对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。因此，正确选择和设计表达载体，能大幅度地提高外源基因的表达效率。对表达载体的改进和优化主要表现在以下几个方面。
1.提高表达质粒的稳定性
重组质粒的不稳定性，是指重组菌在培养过程中重组质粒发生突变或丢失，结果使重组菌失去了原有的表型特征。依据重组质粒的变化本质，质粒不稳定性可分为结构不稳定性和分离不稳定性两种。①质粒的结构不稳定性主要是由于DNA的插入、缺失或重排等引起的不稳定，使目的基因功能丢失，但对质粒主要遗传标记丢失影响较小。②质粒的分离不稳定性是细胞在分裂后分离时引起的不稳定，由于质粒在子代细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含质粒，是质粒丢失的主要原因。质粒的分离不稳定性常出现在两种情况：一是传代质粒只在许多世代之后才明显产生丢失；二是带有质粒的细胞与无质粒细胞有不同的生长速率。外源基因的存在犹如细胞内存在多拷贝的质粒一样，对宿主是一种代谢负担，当外源基因大量产生特异蛋白时，这种代谢压力就变得更加严重。一般条件下，带有重组质粒的宿主菌的生长速率低于无质粒的细菌，因此，质粒的稳定性随着生长速率的不同而变化。
从表达载体方面考虑，提高质粒稳定性的策略有：①选择大小合适的质粒。为了构建稳定的结构体，最好利用小的质粒，小的质粒在高密度发酵中遗传性状比较稳定，而大的质粒往往由于发酵环境中各种因素的影响出现变异的概率较大。②在构建质粒载体时将par基因引入表达质粒中。例如：parB、parD和parE基因的插入，可提高重组质粒稳定性。将pSC101的par基因克隆在pBR322类型的质粒上，或将R1质粒上的parB基因构建到普通质粒上，其表达产物可选择性杀死由于质粒分配不均而产生的无质粒菌体细胞。将parDE基因插入pST1021等质粒上可以提高重组质粒的遗传稳定性，提高基因工程菌的应用效果。利用RK2质粒的parDE片段提高重组质粒在生防菌、成团泛菌中的稳定性。③正确设置质粒载体上的多克隆位点，避免将外源基因插入质粒的稳定区域内，减少外源基因的干扰。④将大肠杆菌中的ssb基因克隆到质粒载体上，该基因编码的单链结合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）是DNA复制必需的因子，因此无论何种原因丢失质粒，由于同时丢失SSB，均不能再继续增殖。⑤在质粒构建时，加入抗生素抗性基因。在生物反应器的培养基中，加入抗生素以抑制无质粒细胞的生长和繁殖。⑥利用营养缺陷型细胞作为宿主细胞，构建营养缺陷型互补质粒。设计营养缺陷型培养基，抑制无质粒细胞的生长和繁殖。⑦利用噬菌体抑制及转化子中自杀蛋白的表达，在含“选择压”的培养基中培养基因工程菌可以有效地抑制无质粒细胞的生长和繁殖，提高质粒稳定性。这种方法由于质粒或宿主细胞本身发生了突变，虽保留了选择性标记，但对于不能表达目的产物的细胞无效。
2.提高表达质粒的拷贝数
通常情况下，目的基因的扩增程度同基因表达成正比，所以基因扩增为提高外源基因的表达水平提供了一种方便的方法。对于表达系统而言，选择高拷贝数的质粒，以其为基础构建外源基因的表达载体。例如，大肠杆菌中经常以pUC质粒（拷贝数500～700）及其衍生质粒为基础，组建表达质粒。
3.启动子的选用和改造
有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键因素之一，也可以说，转录起始是基因表达的主要限速步骤。因此，选择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。最理想的可调控启动子应该是，在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。当细胞达到一定的密度，通过多种诱导（如温度、药物等）使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。原核细胞表达系统中通常使用的可调控的启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）、PL（λ噬菌体的左向启动子）等。而T7噬菌体启动子为组成型启动子，它能被T7噬菌体RNA聚合酶识别，它的转录活性非常强，远远超过宿主细胞的RNA聚合酶的活性。由于T7噬菌体RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7噬菌体启动子控制下的所有的基因序列，因此，T7噬菌体启动子可对外源基因进行高效表达。对于此类载体，T7噬菌体RNA聚合酶可以被严格诱导调控表达，从而使外源基因被严格调控表达。T7噬菌体启动子调控下的表达载体已形成一个系列，根据外源基因的插入位点不同，可以分为直接表达载体和融合表达载体。
4.转录的有效延伸和终止
外源基因的转录一旦起始，那么接下来的问题是如何保证mRNA有效地延伸、终止以及稳定地积累。然而，在转录物内的衰减和非特异终止可能诱发转录中的mRNA提前终止。衰减子具有简单终止子的特性，在原核生物中位于启动子和第一个结构基因之间。由于衰减子是负调控因子，在表达载体的构建中要尽量避免衰减子的存在。为了防止转录的非特异性终止，可将抗终止元件加入表达载体上。
正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个重要因素。其作用是防止不必要的转录，增加表达质粒的稳定性。因此，在设计表达载体时要考虑在外源基因插入位点的末端加入强的终止子序列。
5.翻译的有效起始和终止
在原核生物中，影响翻译起始的因素如下：①AUG是最首选的起始密码子。GUG、UUG、AUU和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。②核糖体结合位点的有效性。SD序列是指原核细胞mRNA 5'端非翻译区同16S rRNA 3'端的互补序列。不同来源的宿主细胞，载体的SD序列是不完全一样的。载体的SD序列要与宿主细胞相对应，才能起始蛋白质的翻译。SD序列的存在对原核细胞mRNA翻译起始至关重要。③SD序列和起始密码子AUG的间距。AUG是最首选的起始密码子，SD序列与起始密码子之间的距离以6～12 bp为宜。④除SD序列外，处于起始密码子5'端的核苷酸应该是A和U。⑤在起始密码子AUG后面的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高。⑥在翻译起始区周围的序列防止转录后形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件如AUG、SD序列易被核糖体识别和结合。以上述原则设计表达载体，可使翻译起始更有效。
翻译终止后多肽链的释放由两个释放因子控制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。其中，UAA在基因高水平表达中终止效果最好，为两个终止释放因子所识别，因此，在基因合成中以AUU为终止密码子。在实际操作中，为了保证翻译有效终止，使用串联的终止密码子，而不只用一个终止密码子。