5.5.1　应用扣除文库分离目的基因

扣除杂交又叫扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是利用分子杂交，除去那些普遍共同存在的或是非诱发产生的cDNA序列即非差异表达基因的cDNA，保留差异表达的基因的cDNA并制备文库，即扣除文库（subtractive library），从而使差异表达的目的基因得到有效富集，提高将来分离的敏感性。

扣除文库也称差减文库，选用两种遗传背景一致或大致相同，但在个别功能或特性上不同的材料，提取mRNA逆转录合成cDNA，在合适条件下，用不含目的基因的一方作为驱动子（driver），含有目的基因的作为试验方（tester），过量的驱动子与试验方进行杂交，选择性地将两者共同表达的cDNA去除，重复多次地杂交、去除，最后将含有目的基因的未杂交部分收集，连接到载体构建扣除文库。

1.构建扣除cDNA文库

下面以T细胞受体（T-cell receptor，TCR）编码基因的分离为例，说明扣除杂交的过程。

T细胞只能识别展现在其他细胞表面的抗原而不能识别游离的抗原，T细胞的这种抗原识别特异性是由TCR基因决定的。TCR基因只在T细胞中表达，而不在B细胞中表达。制备T细胞mRNA的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA杂交。所有能在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA，都与B细胞的mRNA形成DNA-RNA杂交分子，而不在B细胞中表达的T细胞特有的cDNA，因不能形成DNA-RNA杂交分子，仍然处于单链状态。将杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxy apatite column），DNA-RNA杂交分子结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收到的T细胞特异的cDNA转为双链cDNA并克隆，得到T细胞特异的扣除cDNA文库。筛选文库，结果成功地分离到T细胞的TCR基因。

2.构建扣除基因组文库

扣除杂交同样也可用来构建扣除基因组文库分离缺失突变基因，如图5-15所示。制备野生型DNA，用合适限制性核酸内切酶如Sau3AⅠ酶解成小片段。另外，制备缺失突变型DNA，随机切割后用生物素（biotin）标记做探针，同野生型DNA小片段变性、退火杂交。将杂交混合物通过生物素结合蛋白质柱（avidin column），大部分野生型DNA片段因同突变型DNA探针杂交结合到柱上，而野生型DNA片段中没有杂交的部分随柱流出，将洗涤收集的DNA同超量的探针再杂交，再过柱。如此重复富集之后，用PCR扩增DNA片段并克隆。最后用菌落原位杂交鉴定出只同野生型DNA杂交而不与突变型DNA杂交的含有突变基因的阳性克隆。

图5-15　扣除杂交分离目的基因

（引自吴乃虎，1998）
（A）野生型及突变型DNA的切割；（B）DNA变性并与生物素标记探针杂交；（C）过生物素结合蛋白质柱；（D）PCR扩增；（E）连接转化形成克隆库。

扣除文库是否构建成功很大程度上取决于扣除杂交的效率。扣除杂交的方法除以上介绍的羟基磷灰石柱层析法（HAP）和生物素标记链亲和蛋白结合排除法外，目前最为常用的是抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）法。