4.2.2 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖做支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构，带电颗粒通过时会受到阻力，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且取决于分子大小，这就大大提高了其分辨率。其分离原理与其他支持物电泳最主要的区别，是它兼有分子筛和电泳的双重作用。但由于琼脂糖凝胶孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。下面就以分离DNA为例，介绍琼脂糖凝胶电泳。
1.琼脂糖凝胶电泳的原理
核酸是两性电解质，在常规的电泳缓冲液（pH值约为8.5）中带负电荷，在电场中向正极移动。泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率主要由下列几种因素决定。
（1）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中的移动距离不仅和相对分子质量有关，还和它本身构象有关。相同相对分子质量的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动时，超螺旋DNA移动得最快，开环状DNA移动得最慢。
（2）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA相对分子质量的对数成反比，分子越大则所受阻力越大，迁移越慢。
（3）电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同相对分子质量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2 kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5 V/cm。
（4）离子强度。电泳缓冲液的组成及离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（例如误加10×电泳缓冲液），则电导率很大并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
2.琼脂糖凝胶的浓度
一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3％～2％。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段，具体见表4-1。
表4-1 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子有效分离范围
续表
3.电泳缓冲液
电泳缓冲液是指在进行电泳时所使用的缓冲液，其主要作用是维持合适的pH值并使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移。电泳缓冲液中的EDTA可以螯合Mg2+等离子，有防止激活DNA酶的作用。常见的琼脂糖核酸电泳缓冲液有TAE（Tris+EDTA+乙酸）、TBE（Tris+EDTA+硼酸）和TPE（Tris+EDTA+磷酸）。
TAE的缓冲容量较低，长时间电泳会被消耗，阳极一侧则发生酸化，向阳极移动的溴酚蓝的颜色将会由蓝色变到黄色（从pH 4.6开始至pH 3.0结束）。TBE与TPE比TAE缓冲容量大，同时双链线状DNA片段在TAE比在TBE或TPE中的迁移快10％。对于高相对分子质量DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低相对分子质量DNA，TAE的分辨率要低一些，超螺旋DNA在TAE中的分辨率也高于TBE。电泳缓冲液使用多次后，离子强度降低、pH值升高，缓冲能力下降，可使DNA条带模糊或不规则DNA条带迁移。
4.上样缓冲液
上样缓冲液（loading buffer）是上样时与样品一起加入泳道的缓冲液。上样缓冲液一般含有甘油或蔗糖，以及溴酚蓝和二甲苯青FF两种示踪染料。上样缓冲液中的甘油或蔗糖有增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，防止样品扩散的作用，示踪染料除使样品带有颜色以便于上样操作外，主要是用以判断DNA片段的电泳进行情况。如在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长300 bp的线状双链DNA相同，而二甲苯青FF迁移速率约与4000 bp的DNA相同。上述关系在0.5％～1.4％浓度范围内的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。
5.DNA Marker
DNA琼脂糖凝胶电泳可使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段的分子大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。同时可以依据DNA Marker中已知条带的亮度（浓度为已知）粗略估测样品DNA片段的浓度。
6.凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），它染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。现在也开发出了安全的染料，如SYBR GreenⅠ、SYBR Gold、GelRed和GelGreen等。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，则条带不易观察，出现条带模糊的现象。