4.7.1 酵母双杂交系统
1.酵母双杂交系统的基本原理
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物细胞基因转录起始需要反式转录激活因子的参与。如酵母转录激活因子GAL4在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD），BD可识别DNA上的特异序列，并使AD定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。正是利用这一特性建立了酵母双杂交系统，即将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使AD和BD互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录（图4-18）。
图4-18 酵母双杂交系统原理图
2.双杂交系统的建立
（1）将编码BD的基因（DNA结合域）与已知蛋白的cDNA序列（编码诱饵蛋白）融合，构建成一个诱饵质粒，可以在酵母细胞中表达诱饵融合蛋白（BD-bait protein）。
（2）将待筛选蛋白的cDNA序列与编码AD的基因（转录激活域）融合，构建成文库质粒（AD-library）。
（3）将诱饵质粒与文库质粒共转化于酵母细胞中。
（4）酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的Ade、His、lac Z、Mel等报告基因的表达，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。
（5）将阳性反应的酵母菌株中的AD-library载体提取分离出来，并对载体中插入的基因进行测序和分析。
3.酵母双杂交系统的操作程序
酵母双杂交系统的操作程序如下：①选择合适酵母作为筛选未知蛋白的受体菌；②诱饵蛋白表达质粒的构建和鉴定；③诱饵蛋白自身转录活性分析；④猎物蛋白cDNA文库的构建；⑤酵母双杂交筛选与阳性克隆鉴定。这是筛选相互作用蛋白时的基本步骤，如果需要利用双杂交进行其他方面的研究，可根据不同实验目的进行相应调整。
4.酵母双杂交系统的应用
（1）利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白质，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-library载体，并从中进一步克隆得到相应的cDNA片段，并将其在GenBank中进行比较，研究其与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关性的主要方法。
（2）利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用。虽然利用酶联免疫、免疫共沉淀技术可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是在体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。
（3）利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响。酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白质相互作用可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
（4）利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图。众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等利用酵母双杂交技术，以所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白质，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。这对于认识一些重要的生命活动（如信号传导、代谢途径等）有重要意义。