5.1.2 寡核苷酸化学合成
固相亚磷酸三酯法是在固相载体上完成DNA的合成，由引物的3'末端向5'末端合成。所要合成的寡核苷酸链3'末端核苷（N1）的3'-OH通过长的烷基臂与固相载体多孔玻璃珠（controlled pore glass，CPG）共价连接，N1的5'-OH用4，4'-二甲氧基三苯甲基（DMT）保护。然后按3'→5'的方向依次将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，核苷的5'-OH被DMT保护，3'末端的二丙基亚磷酸酰上磷酸的OH用β-氰乙基保护，苯甲酰基用于腺苷和胞苷氨基保护，异丁酰基用于鸟苷环外氨基保护。每延伸一个核苷酸需进行四步化学反应，寡核苷酸链的合成过程如图5-1所示。
图5-1 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸片段
1.合成
一个合成循环包括四个步骤。
（1）去保护（deprotection）：将预先连接在固相载体上带有保护基的末端核苷酸，用三氯乙酸溶液处理，脱去其5'末端的保护基DMT，游离出5'-OH。
（2）偶联反应（coupling）：合成DNA的原料（亚磷酰胺保护的核苷酸单体）与活化剂四唑混合，得到反应活性很高的核苷亚磷酸活化中间体（其3'末端被活化，5'-OH仍然被DMT保护），与核苷N1上游离的5'-OH发生偶联反应，迅速形成亚磷酸三酯键。
（3）加帽反应（capping）：缩合反应中可能有极少数（小于2％）5'-OH没有参加反应，加帽反应中使用乙酸酐和N-甲基咪唑使这些核苷5'-OH乙酰化，终止其反应而成为短片段，这种短片段在纯化时分离掉，如此有利于合成全长的DNA片段。
（4）氧化反应（oxidation）：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，加入氧化剂碘，使三价的核苷亚磷酸酯转变为更稳定的核苷磷酸三酯（五价磷酸）。
经过以上四个步骤循环一次，核苷酸链向5'-OH方向延伸一个核苷酸，接长的链始终固定在固相载体上，过量的未反应物或分解物则通过洗涤除去。每延长一个核苷酸约需10 min。当整个链达到预定的长度后，从固相载体上切下，氨解脱去保护基，经过分离纯化得到所需要的最后产物。
2.合成后处理
合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，在核苷酸链合成完毕以后，要经过以下合成后处理才能最后应用。
（1）切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3'-OH。
（2）脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丙酰基则要在浓氨水中55℃放置15 h左右方能脱掉。
（3）纯化及鉴定：纯化主要是去掉短的寡核苷酸片段、盐及各种保护基等杂质。纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。采用末端标记后聚丙烯酰胺凝脉电泳以及直接测序等方法进行鉴定。
寡核苷酸片段的收率取决于每步循环反应的效率及产物长度。目前DNA自动合成仪每步循环的效率达99％，则合成20 mer寡核苷酸的收率为83％（0.9919），合成50 bp和60 bp的寡核苷酸的收率分别为61％和55％，利用这种方法最多可以合成长达200个碱基的寡核苷酸片段（此时理论收率为14％）。