6.3.1 载体遗传标记筛选法
根据载体分子所提供的表型特征选择重组体DNA分子的遗传选择法，适用于大量群体的筛选，因此是一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使用的所有载体分子，都至少含有一个选择标记。质粒常有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）。根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选，是获得重组体DNA分子必不可少的条件之一。实际操作中，最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用，或是β-半乳糖苷酶的显色反应，将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来。而对于λ噬菌体的置换型载体来说，λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型λDNA长度的75％～105％（36～51 kb），这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的λ重组体分子都带有外源DNA的插入片段。噬菌斑的形成本身就是对λ重组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，因此又称为平板筛选法。
1.根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
抗药性标记的插入失活作用，或者诸如半乳糖苷酶基因一类的显色反应，是依据载体编码的遗传特性选择重组体分子的典型方法。
1）抗药性标记插入失活选择法
pBR322质粒是DNA分子克隆中最常用的一种载体分子。它的相对分子质量小，仅为2.9×106，而且编码有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）。只要将转化的细胞培养在含有四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便可以容易地检测出获得了此种质粒的转化子细胞。
检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活（insertional inactivation）效应。在PBR322质粒的DNA序列上，有许多种不同的限制性核酸内切酶的识别位点都可以接受外源DNA的插入。由于在Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶的单一识别位点，在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致Tetr基因出现功能性失活，于是形成的重组质粒都将具有AmprTets的表型。如果野生型的细胞（Amps Tets）用被BamH Ⅰ或SalⅠ切割过并同外源DNA限制性片段退火的pBR322转化，然后涂布在含有氨苄青霉素的琼脂平板上，那么存活的Ampr菌落就必定是已经获得了这种重组体质粒的转化子克隆。接着进一步检测这些菌落对四环素的敏感性。由于pBR322质粒还带有Tetr基因，因此，Ampr菌落同时具有Tetr的表型，除非外源DNA片段的插入导致Tetr基因失活。由此可以推断，具AmprTets表型的细胞所携带的pBR322 DNA在其Tetr基因内必定带有插入的外源DNA片段。
在涂布之前，先将转化的细胞接种在加有环丝氨酸和四环素的培养基中生长，便可简化这种插入失活检测法的程序。环丝氨酸和四环素对细胞的作用效果各不相同。四环素是抑菌性的抗生素，它能通过抑制细胞蛋白质的合成迫使细菌停止生长，但不致死亡；氨基酸的类似物环丝氨酸，如果在细胞生长分裂过程中掺入新合成的蛋白质多肽链中，则会导致细菌死亡。因此，培养在这种生长培养基中的细胞因为能够生长，所以被周围培养基环境中的环丝氨酸杀死。而Tets细胞由于生长受到抑制，从而避免了环丝氨酸的致死作用，结果便存活下来。将经过如此处理的细胞涂布在含有氨苄青霉素的琼脂平板上，所形成的具AmprTets表型的菌落，全都带上了具有外源DNA插入片段的pBR322质粒分子。
此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中，也有一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点。因此，插入失活作用检测法对于这个位点同样也是适用的，当然，所挑选的菌落应该是具AmpsTetr的表型。pBR322的Ampr基因在正常情况下能够表达产生β-内酰胺酶，在β-内酰胺酶的β-内酰胺化作用下，青霉素会转变成青霉酮酸，即一种Ampr基因表达产物的作用结果。当加入碘-青霉素指示液（30％I2、1.5％KI和5％青霉素G），在0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.4）条件下，AmprTetr表型菌落为无色、透明状。但pBR322DNA用Pst Ⅰ酶切割并插入外源DNA片段时，Ampr基因失活，AmpsTetr表型菌落在这种指示液中不退色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜色的改变与否，很容易鉴别出哪些菌落是重组体。这种方法的优点是无须把每一个转化子接种在Amp和Tet平板上，直接在转化平板上即可鉴定。其缺点是由于把指示液直接加入选择平板内，极易造成菌落之间的相互污染，给其后的鉴定带来困难。目前使用纸片法使这一方法得到改善。预先将一定大小的纸片浸泡在指示液中，干燥后密闭保存。使用时只要将纸片覆盖在转化平板上，数分钟内就可以观察到结果。插入失活筛选出来的克隆并不完全是含有目的基因的重组体。由于所使用的试剂质量（如限制性核酸内切酶和连接酶的纯度）或操作方面的问题，自身环化的载体分子有时也会失去特定的遗传标记。尽管如此，作为初级筛选，插入失活无疑是一种简便、快速的方法，它使以后的鉴定减少盲目性，并大大减少工作量。
2）β-半乳糖苷酶显色反应选择法
根据插入失活原理设计的筛选重组体分子的方法，需要进行菌落平板的影印复制，才能识别出由此而丧失的表型特征，这样势必给重组体的筛选工作带来不少的麻烦。因此，有许多实验室都曾致力于发展可适用于半乳糖苷酶显色反应的高敏感度的载体系列。应用这样的载体系列，外源DNA插入它的lac Z'基因上所造成的β-半乳糖苷酶α肽失活效应，可以通过大肠杆菌转化子菌落在Xgal-IPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。β-半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。将pUC质粒转化的细胞培养在补加有Xgal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝（5-bromo-4-chloro-indigo），使菌落呈现出蓝色反应。在pUC质粒载体lac Z'序列中，含有一系列不同限制性核酸内切酶的单一识别位点，其中任何一个位点插入外源克隆DNA片段，都会阻断读码结构，使其编码的α肽失去活性，结果产生白色的菌落。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组克隆（图6-6）。
图6-6 应用于蓝白斑筛选的质粒
3）利用报告基因筛选植物转化细胞
在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因（reporter gene）。在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况并推测基因调控序列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferase-Ⅱ，NPT Ⅱ）基因：新霉素（neomycin）与卡那霉素（kanamycin）、庆大霉素和G418等均属于氨基环醇类抗生素，它们的结构相似，能抑制原核细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍蛋白质的合成，进一步抑制细胞的生长。npt Ⅱ基因编码序列来自大肠杆菌转座子Tn5，它可以催化ATP上γ-磷酸基团转移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选择培养基上培养植物转化材料，仅有携带npt Ⅱ基因的转化植物细胞才能存活下来，由此将转化子与非转化子区别开来。基因对大多数植物而言是很强的选择标记，应用广泛。但该基因作为选择标记基因的缺点是，受体细胞通常具有较高的非特异性磷酸转移酶本底值，筛选时假阳性率高。NPT Ⅱ酶活性一般通过卡那霉素与［γ-32 P］-ATP的原位磷酸化作用来检测。
（2）氯霉素乙酰转移酶基因（cat）：氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶的活性，从而阻断肽键的形成并最终抑制细胞生长。cat基因是由大肠杆菌转座子Tn9编码。它可以催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素失活。因此与外源DNA共转化的cat基因能使转基因植株细胞具有抗氯霉素的能力。由于植物细胞中非特异性CAT酶活性本底值很低，CAT酶检测的灵敏度很高，因此cat基因经常用于植物基因转化中，特别是瞬时表达实验中。当细胞提取物与乙酰辅酶A及14 C标记的氯霉素一起温育时，如果细胞中有CAT酶存在，氯霉素便被乙酰化。经薄层层析分离未乙酰化的底物和乙酰化的产物，通过放射自显影技术即可测定乙酰化的产物。
（3）葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因：gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的GUS产物。与抗生素抗性基因不同的是，gus基因并非正选择标记，其作为报告基因的筛选依据是，作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的GUS能够催化某些特殊反应的进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测即可确定gus报告基因的表达情况，以此区分转化子和非转化子。例如，GUS能催化裂解人工合成的底物4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，可利用荧光光度计进行定量测定。由于植物细胞GUS本底值非常低，同时其检测方法简便、快捷、灵敏度高，因此gus基因已被广泛使用于植物基因转化实验中，尤其是在进行外源基因瞬时表达系统中。此外，gus基因的3'端与其他结构基因所产生的嵌合基因可以正常表达，所产生的融合蛋白中仍有GUS活性，利用组织化学分析等可以定位外源基因在不同的细胞、组织和器官类型以及发育时期的表达情况，这是其他报告基因所不及的。
4）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶基因（cat）和新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ）也可作为遗传选择标记用于哺乳动物转基因细胞的筛选，除此之外，常用的标记基因还有胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）等。
（1）胸腺核苷激酶基因（tk）：胸苷激酶（thymidine kinase，TK）是胸腺核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能够把胸苷转换为胸苷-磷酸，保证核苷酸的顺利合成。胸苷激酶的编码基因（tk）几乎在所有的真核细胞中都能有效地表达，因此可采用这种基因作为遗传选择记号以确定哺乳动物基因转移，相应的受体细胞为遗传标记遗传表型的缺陷型。
（2）二氢叶酸还原酶基因：二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，它可催化二氢叶酸（DHF）还原成四氢叶酸（THF）。对于dhfr突变体细胞而言，由于它不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长。不过，如果在常规培养基中加入次黄嘌呤和胸苷，则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。具体利用dhfr基因进行筛选时，首先须将重组DNA分子导入dhfr-表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+表型且能表达外源基因的克隆细胞系。这就是dhfr基因作为选择标记的依据所在。
2.根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法
这种选择法的基本原理是，转化进来的外源DNA编码的基因能够对大肠杆菌宿主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的宿主细胞表现出外源基因编码的表型特征。例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，对于大肠杆菌宿主菌株的不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。目前已拥有相当数量的对其突变进行了详尽研究的大肠杆菌实用菌株，而且其中有多种类型的突变，只要克隆的外源基因的产物获得低水平的表达，便会被抑制或发生互补作用。
lacY是大肠杆菌的乳糖操纵子中编码半乳糖苷透性酶的结构基因，其大小约为1.3 kb。大肠杆菌基因组约为4000 kb，用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ切割，会得到大约1000个大小不同的片段。其中某一片段上可能携带lacY基因。用pBR322做载体，将外源DNA片段插入切点上。重组体通过转化导入宿主细胞。该宿主携带两个遗传标记：一是对氨苄青霉素敏感（Amps）；二是不能合成β-半乳糖苷透性酶（LacY-），即不能利用乳糖。当在含有氨苄青霉素和乳糖的基本培养基上选择时，只有Ampr和LacY+细胞才能生长。这是因为pBR322的Ampr基因赋予宿主细胞以氨苄青霉素抗性，lacY基因则弥补了宿主细胞的遗传缺陷。lacY基因随宿主细胞进行扩增，从而得到它的无性繁殖系（克隆）。
J.R.Camerori等在1975年将野生型的大肠杆菌DNA连接酶基因克隆到λgt·λB噬菌体载体上，由于C片段的缺失而造成重组缺陷的λred-噬菌体载体，在允许的温度下，生长在大肠杆菌lig ts菌株上并不能形成噬菌斑，但能在具有连接酶功能的大肠杆菌lig+菌株上形成噬菌斑。因此J.R.Camerori等构建带有连接酶基因的重组体噬菌体λgt·λB，当其被涂布在大肠杆菌lig ts平板上时，通过同宿主细胞缺陷型之间的互补作用，便能够形成噬菌斑。于是根据能形成噬菌斑这种表型特征，可十分方便地选择出具有野生型连接酶功能的重组体噬菌体。
研究表明，一些真核的基因能够在大肠杆菌中表达，并且能够同宿主菌株的营养缺陷突变发生互补作用。例如，将机械切割产生的酵母DNA片段，经过同聚物加尾之后插入质粒载体，再用这种重组体质粒转化大肠杆菌hisB突变体，通过互补作用选择程序分离到一种携带着表达酵母his基因的克隆。
根据克隆片段给宿主提供的新的表型特征选择重组体DNA分子的直接选择法，是受一定条件限制的，它不但要求克隆的DNA片段大到足以包含一个完整的基因序列，而且要求所编码的基因能够在大肠杆菌宿主细胞中实现功能表达。无疑，真核基因是比较难以满足这些要求的，其原因在于有许多真核基因是不能够同大肠杆菌的突变发生抑制作用或互补效应的。此外，大多数的真核基因内部存在着间隔序列，而大肠杆菌又不存在真核基因转录加工过程中所需要的剪接机理，这样便阻碍了它们在大肠杆菌宿主细胞中实现基因产物的表达。当然，在有些情况下，是可以通过使用mRNA的cDNA拷贝构建重组体DNA的办法来解决这些问题的。
3.根据插入基因遗传性状的筛选
重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。例如，当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长，因此，获得的转化子都是重组子。
4.营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的克隆子。如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。例如，要从某种生物的cDNA文库中调出二氢叶酸还原酶基因（dhfr），则可根据二氢叶酸还原酶能降解三甲氧苄二氨嘧啶（trimethoprim）的性质，将cDNA文库的一系列克隆子接种在含有适量三甲氧苄二氨嘧啶（该化合物会抑制大肠杆菌的生长）的培养基上，能正常生长的克隆子中含有dhfr基因。值得注意的是，这种方法的使用前提是待选择的目的基因能在受体菌中进行表达。但并不是所有真核基因都能在大肠杆菌中表达的。特别是用基因组文库的方法获得的转化菌株中，目的基因含有间隔序列，而大肠杆菌不具备真核基因转录加工过程中所需的剪切机制，真核目的基因在大肠杆菌中不会表达。
5.形成噬菌斑筛选法
对于λDNA载体系统而言，外源DNA插入λ噬菌体载体后才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，转导受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。如果在重组过程中使用的是取代型λ载体，则噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子，因为空载的λDNA分子不能被包装，难以进入受体细胞产生噬菌斑。如使用插入型λ载体，由于空载的λDNA大于包装下限，因此也能被包装成噬菌体颗粒并产生噬菌斑，此时筛选重组子可以利用λ载体上的筛选标记基因，如lac Z'等。当外源DNA片段插入lac Z'基因内时，重组噬菌斑无色、透明，而非重组噬菌斑则呈蓝色。