3.2.3 载体中常用的遗传标记基因
1.抗性筛选基因
（1）氨苄青霉素抗性基因（Ampr）：氨苄青霉素（ampicillin）作为青霉素的衍生物，通过抑制细菌细胞壁合成而抑制细菌生长。氨苄青霉素抗性基因（Ampr）编码β-内酰胺环水解酶，其分泌到细菌细胞周质区后，催化氨苄青霉素β-内酰胺环水解，使氨苄青霉素失活。
（2）氯霉素抗性基因（Cmlr）：氯霉素（chloromycetin）可以结合核糖体50S亚基，影响细菌蛋白质合成，抑制细菌生长。Cmlr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化而失活。
（3）卡那霉素抗性基因（Kanr）：卡那霉素（kanamycin）为氨基糖苷类药物，可以结合细菌核糖体70S亚基，导致mRNA翻译过程出错，发挥杀菌作用。卡那霉素抗性基因（Kanr）来自转座子（又称转位子、易位子）Tn5和Tn903，编码氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素有修饰作用，修饰导致卡那霉素丧失与核糖体的相互作用能力。卡那霉素抗性基因也可以用于真核细胞G418筛选。
（4）新霉素抗性基因（Neor）：新霉素（neomycin）和G418为氨基糖苷类药物，作用机理和卡那霉素类似，都结合核糖体阻止蛋白质合成，从而发挥杀菌作用。新霉素抗性基因（Neor）编码氨基糖苷磷酸转移酶，对抗生素有修饰作用，修饰导致抗生素丧失与核糖体的相互作用能力。此筛选标记可用于真核细胞稳定转染细胞系的筛选，如在真核细胞表达载体pcDNA3.1系列载体中，摄入了载体的真核细胞可表达新霉素抗性基因（Neor），用G418筛选转染细胞，从而建立稳定转染细胞系。
（5）四环素抗性基因（Tetr）：四环素（tetracycline）可以结合细菌核糖体30S亚基，抑制核糖体转位，影响蛋白质合成，抑制细菌生长。四环素抗性基因（Tetr）编码399个氨基酸的蛋白质，这种蛋白质对细胞膜进行修饰后，阻止四环素进入细菌细胞，从而导致四环素失去抑菌作用。
（6）链霉素抗性基因（Smr）：链霉素（streptomycin）为氨基糖苷类药物，可以结合核糖体30S亚基，从而引起mRNA蛋白翻译错误，发挥杀菌作用。链霉素抗性基因（Smr）编码一种链霉素磷酸基团修饰酶，可以抑制链霉素同核糖体的结合，导致链霉素失效。
2.营养缺陷型筛选基因
营养缺陷型筛选标记多用于酵母细胞转化子的筛选，此筛选系统需要配合营养缺陷型酵母细胞株，在缺少特定营养成分的条件培养基下使用。这类标记基因编码特定必需氨基酸或核苷酸合成酶。在缺陷型宿主细胞中，只有摄入载体的宿主细胞才能正常合成必需的营养物质，保证细胞正常生长；未摄入载体的宿主细胞会因缺少特定营养物质无法生存。常用的营养缺陷型筛选标记中，氨基酸类包括亮氨酸（Leu）、组氨酸（His）、色氨酸（Trp）和赖氨酸（Lys）合成基因，核苷酸类包括尿嘧啶（URA）和腺苷酸（ADE）合成基因。
3.生化筛选标记和报告基因
生化筛选标记和报告基因是质粒载体的一个非必需组件，多种质粒载体内并不含有这些结构，但这些功能性元件使质粒载体具备多种不同功能，如β-半乳糖苷酶α片段基因（lac Z'）使筛选重组体更加便利，而绿色荧光蛋白（GFP）或萤火虫荧光素酶等报告基因使载体成为研究DNA特定功能的有力工具。
（1）β-半乳糖苷酶α片段基因（lac Z'）：β-半乳糖苷酶是大肠杆菌乳糖代谢通路中的一种关键酶，当细菌生长环境中没有葡萄糖而有乳糖存在时，细菌代谢乳糖为细菌生长繁殖提供能量。β-半乳糖苷酶在这一过程中将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。在细菌细胞中lac Z编码β-半乳糖苷酶，可以将乳糖类似物X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）水解，X-Gal被切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，呈蓝色，便于检测和观察。
科研人员利用α-互补（α-complementation）策略成功将lac Z开发成报告基因，同时避免了细菌内天然β-半乳糖苷酶对实验结果的影响。天然的β-半乳糖苷酶是由4个亚基组成的四聚体。科研人员将E.coli的一段调节基因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因插入载体的MCS区域，这段序列编码产物为β-半乳糖苷酶的a片段，通常被标记为lac Z'。这种载体在工作时需要配lac Z α片段突变的变异菌株，此菌株所产生的β-半乳糖苷酶α片段突变，不具备正常活性，当变异菌株获得能够表达正常lacZα片段的载体后，载体所表达的α片段（N端）同菌株中表达的缺陷型β-半乳糖苷酶C端互补，从而形成具有正常功能的β-半乳糖苷酶，遇到底物X-Gal后显蓝色，发挥报告基因的作用。这一过程称为α-互补。
β-半乳糖苷酶α片段基因（lac Z）的诸多优点使它成为基因工程实验中一个常用标记基因，如lac Z'常被用于重组体转化菌落筛选，即蓝白斑筛选。基因克隆中常用的质粒载体pUC19、pGEM-T和噬菌体载体M13系列均带有lac Z'基因。在pGEM-T系列载体中，外源DNA的插入位点位于β-半乳糖苷酶a片段基因（lac Z'）编码区内。当外源DNA成功插入载体后，将会引起lac Z'插入失活，而宿主菌为lac Z突变的菌株，无法合成β-半乳糖苷酶，无法催化X-Gal发生蓝色反应，只生成白色单克隆菌落，而未插入外源DNA的载体导入细胞后由于α-互补作用能产生β-半乳糖苷酶，可产生蓝色菌落。通过菌落的不同颜色可以将插入了外源DNA的重组体单克隆菌落筛选出来，极大地提高了克隆基因的效率。
（2）β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）：编码β-葡萄糖苷酸酶，该基因是从E.coli等细菌基因组中分离出来，为一种稳定不易降解的水解酶，以β-葡萄糖苷酯类物质为底物，和底物发生显色反应，可以用于定性、定量检测。由于动物和多数植物基因组中没有gus基因，因此GUS显色反应被广泛应用于动物或植物基因调控研究。检测方法有三种：组织化学法、分光光度法和荧光法。其中分光光度法灵敏度较高，可用于定量检测，组织化学法为最常用的检测方法。例如，在pBI121和pVec8-GUS载体中，gus基因作为报告基因，被用于检测特定基因启动子活性或基因组织表达分布研究。组织化学法检测以X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞发生gus基因的转化，并表达出GUS，在适宜的条件下，该酶就可将X-gluc水解，生成蓝色产物。此过程的原理是X-gluc的初始产物经氧化二聚作用形成靛蓝染料，它使具GUS活性的部位或位点呈现蓝色，便于在显微镜下检测，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性，发挥报告基因的作用。因此，利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织或单细胞内的表达情况。
（3）氯霉素乙酰基转移酶基因（cat）：该报告基因来源于大肠杆菌转座子9，是第一种被用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3-羟基并通过分子内的重排及再度乙酰化生成1，3-二乙酰氯霉素，而使氯霉素失效。cat在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等技术检测其活性，也可进行蛋白质印迹（又叫Western印迹、Western blotting）和免疫组织化学分析。cat与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏度较低。
（4）荧光蛋白基因：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物细胞中发现的发光蛋白。其中，来源于发光水母细胞的绿色荧光蛋白（GFP）是应用最多的发光蛋白。用395 nm的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508 nm处自行发射绿色荧光，不需辅助因子和底物。GFP最大的优势是不需损伤细胞即可观察细胞内情况。1991年克隆了gfp基因，目前已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体（red-shift mutant），其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白（BFP）、增强型GFP（EGFP）和去稳定EGFP（destabilized EGFP）等。不同的报告基因也可以联合应用，同时检测2～3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适用于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。如在pEGFP系列载体中，将目的基因和EGFP的编码序列连接在一起，构建成融合蛋白重组体，转染细胞后，可以实现目的基因亚细胞定位分析，了解目标基因产物在细胞内的位置，为基因的功能研究提供有价值的线索。
（5）荧光素酶（luciferase）基因：编码的荧光素酶是一类催化不同底物氧化发光的酶，哺乳动物细胞无内源性表达。最常用的荧光素酶包括细菌荧光素酶（bacteria luciferase）、萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和海肾荧光素酶（renilla luciferase）。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳动物细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶基因是最常用于哺乳动物细胞的报道基因，萤火虫荧光素酶灵敏度高，用荧光光度计即可检测酶活性，适用于高通量筛选。例如，Promega公司的pGL3系列载体，将具有不同启动子活性的DNA片段插入荧光素酶标记基因上游，将重组载体转染到细胞中，在相同遗传背景细胞中引导荧光素酶表达，利用荧光素酶检测系统灵敏、方便的特点，可以快速检测不同启动子或其截断体的启动子活性。荧光素酶报告基因的优点包括非放射性、检测技术简单、速度快、灵敏度高。此外，由于半衰期短（荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3h，在植物中的半衰期为3.5 h），因此启动子活性的改变会及时引起荧光素酶活性的改变。
4.标签基因
（1）His-Tag：多聚组氨酸标签，是一种融合标签，6×His-Tag相对分子质量大约为6000，可以和目的基因形成融合蛋白，由于组氨酸的咪唑环与金属离子（如镍离子）起化学作用而生成螯合物，可以利用His-Tag标签组氨酸亲和层析纯化融合蛋白。例如，pET系列原核表达载体和真核细胞表达载体pcDNA3.1/V5-His内部带有His-Tag，表达出的目的蛋白和His-Tag形成融合蛋白，利用镍离子柱可以实现目的蛋白的快速纯化。
（2）V5-Tag：此标签是从猿猴病毒5（Simian Virus 5，SV5）的P和V蛋白中分离得到的由14个氨基酸残基（GKPIPNPLLGLDST）组成的肽链，相对分子质量大约为5000。作为一种融合标签，可以和目的基因形成融合蛋白。当目的蛋白没有合适的抗体时，可以利用V5标签的抗体对目的蛋白V5的融合蛋白进行免疫学相关的鉴定和实验。例如，pcDNA3.1/V5-His载体中V5和目的蛋白融合表达后，可以利用V5-Tag抗体进行Western印迹分析，检测目的基因在细胞中的表达量，也可以进行免疫组织化学实验，分析目的蛋白在细胞中的定位或和其他蛋白质的相互作用。
（3）GST-Tag：相对分子质量为26000，为融合蛋白标签。谷胱甘肽巯基转移酶（GST）是在解毒过程中起重要作用的转移酶。它常用于原核表达系统，通常将其和目的基因融合表达，其优点在于GST是高度可溶的蛋白质，可以增加外源蛋白的可溶性。此外，它可以在大肠杆菌中大量表达，起到促进表达的作用；利用凝胶亲和层析系统可以对带有GST标签的融合蛋白进行分离纯化。纯化原理为，纯化柱中凝胶手臂通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶（GST）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白与凝胶中谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白质与其他蛋白质分离开。例如，pGEX系列载体中的GST标签和目的基因融合蛋白原核表达后，利用带有GST标签的融合蛋白可以分离目的蛋白，并分析目的基因的表达产物和其他蛋白质的相互作用。