8.4.1　哺乳动物基因表达载体的组成特征

哺乳动物基因表达载体包括质粒载体和病毒载体两大类。哺乳动物基因表达的质粒载体是一类穿梭质粒载体，能够在细菌和哺乳动物细胞中进行扩增。哺乳动物基因表达载体一般包括以下几个方面：

（1）基因转录元件，如转录的启动子、增强子、终止子、poly（A）信号和内含子剪接信号等；

（2）选择标记基因；

（3）在细菌中进行复制和筛选的元件；

（4）基因表达的调控元件。

早期的哺乳动物表达系统一般是用来研究基因的功能与调控的，所以很多载体都源自动物病毒，如SV40、多瘤病毒（polyomavirus）、疱疹病毒（herpes virus）和牛乳头瘤病毒（bovine papillomavirus）等。从总体上讲，这些载体不适于表达重组蛋白，因为它们的宿主范围有限，而且只是瞬时表达，产率低，克隆步骤烦琐，某些病毒的DNA片段还有潜在的致癌作用（如乙肝病毒，慢性感染可导致肝细胞癌变），不能用于表达供人体使用的药物蛋白或其他蛋白。同时，有些人类医用蛋白只能在哺乳动物细胞中才能正确地修饰，因此研究人员致力于改进原有的载体和开发新的载体，以便哺乳动物细胞能够成为新的生物反应器。

研究人员通过将不同生物的基因组元件整合起来构建复合穿梭载体，克服早期表达载体的缺陷，穿梭载体可以在特定细胞的特定条件下将外源基因转入受体细胞，并进行有效的表达。如穿梭质粒在大肠杆菌和哺乳动物细胞中均可以进行复制，包含原核DNA序列、转录基本元件和筛选标记基因等。pV2（gpt）就是一个SV40载体，它包括pBR322的大肠杆菌复制起始位点、氨苄青霉素抗性基因、大肠杆菌谷氨酸丙酮酸转氨酶基因gpt和SV40的哺乳动物细胞复制起始位点，以及其他一些在哺乳动物细胞中表达所必需的序列。重组子可以通过对gpt进行筛选得到。科学家们利用pV2（gpt）载体已成功地在猴的肾细胞中表达出有活性的兔β珠蛋白。人乳多空BK病毒穿梭载体是另一种重要的哺乳动物基因表达载体，该载体将编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因删除，保留有复制功能的部分，并与大肠杆菌质粒组合构建了穿梭载体（图8-10）。它在大肠杆菌中以质粒形式存在，在人类细胞中不能产生病毒粒子，以染色体外的DNA形式存在。该载体含有一个SV40的新霉素抗性基因（Neor）启动子，一个受细胞色素P450dioxin诱导的增强子（dioxinresponsive enhancer，DRE）调控的小鼠乳腺癌启动子（MMTP），DRE序列在有毒物质二噁英（dioxin）存在时，能增强mRNA的合成。这样就可以用抗生素G418来筛选重组子。

图8-10　哺乳动物细胞-大肠杆菌穿梭载体结构

（引自瞿礼嘉等，1998）