2.4.3　碱性磷酸酶

在基因工程中，常用的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）有两种：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，称为细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）；另一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。它们的作用是催化核酸分子脱掉5'端磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5'-P末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用（图2-18）。

图2-18　碱性磷酸酶的脱磷酸作用

BAP和CIP在实用上有所差别。CIP具有明显的优点，在SDS中加热到68℃就完全失活，而前者却是耐热性的酶，要终止它的作用则要困难得多。即使除去极微量的BAP活性，需要用酚-氯仿多次抽提，而且CIP的活性要比BAP高出10～20倍，因此在基因克隆中CIP更为常用。

碱性磷酸酶在基因工程中主要有两个方面的用途：

（1）在DNA分子体外重组过程，用于去除DNA片段5'端磷酸基团，使所产生的5'端羟基不再参与连接反应，防止载体分子的自身环化。当载体与要插入的外源DNA分子发生退火，由于外源DNA片段带有5'端磷酸基团，能在连接酶的作用下在连接部位形成磷酸二酯键，产生在每一条链上各有一个切口的重组子，这种分子可以防止发生重新解链作用，其上的切口可以在转化后，在宿主细胞内得到修复（图2-19）。

图2-19　载体分子的去磷酸化与外源DNA的连接

（2）可以作为5'末端标记的DNA片段。在5'末端标记之前，去除DNA或RNA分子的5'端磷酸基团，形成5'-OH末端，随后在32P-ATP和T4多聚核苷酸激酶的作用下，使5'端重新磷酸化并带上放射性标记。