9.4.4　外源基因在转化植株中基因表达情况的检测与鉴定

尽管在mRNA水平上也能一定程度地研究外源基因的表达，但存在mRNA在细胞质中被特异性地降解等情况，mRNA与表达蛋白质的相关性不高，基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代基因最终表达产物的研究。转基因植株外源基因表达的产物一般为蛋白质，外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能才是植物基因转化的最终目的。外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，通过目的蛋白（抗原）与其抗体的特异性结合进行检测。ELISA和Western印迹法是蛋白质检测的经典和常用方法。

1.酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫技术。与经典的同位素标记不同之处在于建立了固-液抗原抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。把抗原与抗体反应高度专一性、敏感性与酶的高效催化特性有机地结合起来，从而达到定性或定量的目的。ELISA有直接法、间接法和双抗体夹心法，目前使用得最多的是双抗体夹心法（图9-19），其灵敏度最高。一般ELISA为定性检测，若能作出已知转基因成分浓度与OD值的标准曲线，也可据此来确定样品转基因成分的含量，实现半定量测定。优点：由于酶的放大作用，测定的灵敏度极高，可检测出1 pg的目的产物，同时酶反应还具有很强的特异性。缺点：易出现本底值过高、缺乏标准化等。

图9-19　双抗体夹心法ELISA检测

2.Western印迹法

Western印迹法是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测技术。不同分子大小的蛋白质在凝胶中迁移率不同，蛋白质电泳后转到NC膜，放在蛋白质（如牛血清蛋白）或奶粉溶液中，温育，以封闭非特异性位点，然后与含有放射性标记或酶标记的特定抗体杂交，再通过放射性自显影或显色观察。Western印迹法是在翻译水平上对目的基因表达结果的检测，可检测目的基因是否表达、表达强度及相对分子质量。能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译，最终合成蛋白质而影响植株的性状表现。它具有很高的灵敏度，可以从植物细胞总蛋白中检出50 ng的特异蛋白质。若是提纯的蛋白质，可检出1～5 ng。缺点是操作烦琐，费用较高，不适合进行批量检测。