2.3.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段及其应用
大肠杆菌DNA聚合酶经枯草芽孢杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理，可分解为两个大小不同的片段。其中大片段相对分子质量为76000，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5外切酶活性。它是1970年由Klenow首次利用酶位点特异性降解的方法从大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ中制备的，所以称为Klenow DNA聚合酶、Klenow片段（Klenow fragment）或大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段。目前已将DNA聚合酶基因内的相应编码序列克隆表达，并由重组大肠杆菌廉价生产。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ小片段相对分子质量为34000，只具有5'→3'外切酶活性，很少使用。
在DNA分子克隆中，Klenow DNA聚合酶的主要用途如下：
（1）补平经限制性核酸内切酶消化的DNA所形成的3'隐蔽末端。反应时是利用Klenow DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性，将3'隐蔽末端补平为平末端。需要注意的是反应中需要加入足够的dNTPs，否则会表现出外切酶活性。
（2）切除DNA的3'突出末端。在Klenow DNA聚合酶3'→5'外切酶活性作用下，切除DNA的3'突出末端，反应中仍需要加入足够的dNTPs，否则外切酶活性不会停止。但这一作用现在已为T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶所代替，因为后两者具有更强的3'→5'外切酶活性。
（3）以含有32 P同位素标记的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段的3'末端进行标记。与切口平移法不同，DNA末端标记并不是将DNA片段的全长进行标记，而只是将其中的3'末端进行标记，但是不能有效地标记3'突出的DNA末端。
选用具有3'隐蔽末端的DNA片段做放射性末端标记最为有效。用Klenow DNA聚合酶标记DNA片段末端的原理可简单地概括如下：
具有3'隐蔽末端的待标记的DNA片段
在反应物中加入Klenow DNA聚合酶及a-32 P-dGTP，一起温育后生成
或者是（当α-32 P-dGTP无用时）同α-32 P-dATP+dGTP一起温育生成
或加α-32 P-dCTP、a-32 P-dTTP等。
用限制性核酸内切酶酶切DNA产生平末端片段时，也可以用Klenow DNA聚合酶催化，在平末端标记同位素，使3'端带有羟基的最后一个核苷酸被α-32P-dNTP替换。例如Rsa Ⅰ（GT ↓ AC）
（4）在cDNA克隆中，用于第二链cDNA的合成。反应时是以第一股单链cDNA为模板，以弯曲的短链单股DNA为引物，从引物的5'方向至3'端进行合成。由于该酶没有小亚基，无5'→3外切酶活性，因此5'端DNA末端不会被降解，能合成全长cDNA。
（5）用于Sanger双脱氧链终止法DNA序列的测定。利用Klenow DNA聚合酶测定从引物5'位置起250个碱基以内的一段DNA序列，但不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。