7.3.6 优化发酵条件
在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。为了获得高浓度的工程菌菌体和高表达的外源基因表达产物，基因工程菌通常采用高密度发酵。高密度发酵一般是指菌体干细胞达50 g/L以上的发酵。在发酵过程中，通过延长工程菌对数生长期，相对缩短衰亡期，提高菌体的发酵密度，最终提高外源蛋白的产率，降低生产成本。由于表达系统、表达的外源基因不同，工程菌的发酵模式是不固定的，所以要对发酵条件进行优化。
优化发酵条件既包括生产工艺方面的因素，也包括生物学方面的因素。
1.生产工艺方面的因素
生产工艺方面主要包括选择合适的发酵系统或生物反应器和培养方式。
1）反应器
目前应用较多的生物反应器有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。
2）培养方式
基因工程菌发酵与培养方式也有很大的联系。基因工程菌一般采用高密度发酵，高密度发酵的培养方式主要有补料分批培养、透析培养和固定化培养等，其中以补料分批培养应用最多。
（1）补料分批培养：基因工程菌高密度发酵取得成功的关键在于补料策略，即采用合理的营养流加方式。其中最常用的培养方式是补料分批培养。补料分批培养是指在发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。补料分批培养通过持续供给菌体生长所需要营养，能延长对数生长期，保持较高的菌体浓度，且不断地补料稀释，可以解除底物抑制，稀释有毒代谢产物，降低遗传不稳定性，因此在高密度发酵中应用最多。
（2）透析培养：透析培养是利用膜的半透性，根据分子不平等扩散原理使外源蛋白和培养基分离，从而除去乙酸等小分子代谢产物，解除其对生产菌的抑制作用，并可维持较合适的营养浓度，获得高密度菌体。在大肠杆菌高密度培养中通过透析培养，细胞密度超过190 g/L，300L发酵罐中的蛋白质浓度是补料分批发酵的3.8倍。但是透析培养以生长培养基为透析液，透析过程中大量的甘油被当作废物透析掉，生产中耗资大，目前该方法在实验室中应用较为成功，工业化生产还有待于进一步改善。
（3）固定化培养：固定化培养是通过化学或物理方法，将游离细胞或酶固定于限定的空间区域内，使其保持活性并可以反复利用，具有菌体浓度高、反应速度快、发酵周期短、产物分离操作简单、反应过程容易控制、菌体可重复连续使用和增加发酵过程中重组质粒稳定性等优点，因此固定化培养在基因工程菌发酵中具有很大的应用潜力。利用海藻酸钙固定化乳杆菌，发酵半纤维素水解液生产乳酸，乳酸产量为62.77 g/L，而采用游离细胞发酵产量只有41.30 g/L。
2.生物学方面的因素
外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体浓度可望提高外源蛋白合成的总量。在培养过程中达到最大菌体浓度，需要注意以下几个因素。
1）培养基的组成
高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物，需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。一般使用的培养基为半合成培养基，培养基各组分的浓度和比例要恰当，过量的营养物质反而会抑制菌体的生长，特别是碳源和氮源的比例要控制好。葡萄糖因细菌利用快且价廉易得，已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般葡萄糖浓度控制在10 g/L左右，如果超过20 g/L将会抑制细胞的生长。已有人用甘油代替葡萄糖作为细菌生长的碳源，以减少代谢抑制物质乙酸的积累，更易达到重组菌的高浓度和外源蛋白的高表达。NO
、胰蛋白胨（Tr）、酵母提取物（Ye）作为氮源有利于细胞的生长。比如，在硅藻类高密度培养过程中提高十二碳五烯酸（EPA）的产量时，NO
、Tr、Ye的最佳质量比为1∶2.6∶1.3，Glu、NO
的最佳质量比为32∶1。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率。
另外还有实验数据表明，在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白质表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽（GSH）时，在发酵开始和进行12 h后，各添加2.0 g/L腺苷三磷酸和9 mmol/L前体氨基酸，可以使细胞浓度和GSH的产量分别比不添加这两种物质时提高24％和1.4倍。
2）溶解氧浓度
溶解氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中，由于菌体浓度高，发酵液的摄氧量大，一般通过增大搅拌转速和增加空气流量来增加溶氧量。随着发酵时间的延长，菌体浓度迅速增加，溶解氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期，需要维持较高水平的溶解氧浓度。
目前，提高溶氧量的方法主要有：通入纯氧来提高氧的传递水平，但可能导致局部混合不匀，易使微生物氧中毒；在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白；培养基中添加H2O2，利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生O2；提高氧的分压。
3）pH值
稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。外界的pH值变化会改变菌体细胞内的pH值，从而影响细菌的代谢反应，进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。大肠杆菌发酵时产生的有机酸（主要是乙酸）可导致发酵液的pH值降低，细胞释放的CO2溶解于发酵液内与H2O作用生成的碳酸也会导致发酵液pH值降低。在高密度发酵条件下，细胞产生大量的乙酸和CO2，可使pH值显著降低。必须及时调节pH值，使之处于适宜的范围内，避免因pH值剧烈变化而对细胞生长和代谢造成不利影响。
菌体生长和产物合成过程中，常用于控制pH值的酸碱有HCl、NaOH和氨水等，其中氨水较常被使用，因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现，NH
浓度对大肠杆菌的生长有很大影响，当NH
浓度高于170 mmol/L时，会严重抑制大肠杆菌的生长。
4）温度
培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌高密度发酵，低温培养能提高重组产物的表达量，而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量，并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高，细胞内就会生成某些热激蛋白，以适应变化的环境，使得外源蛋白相对量降低，给后续的纯化造成困难。如果温度升高的幅度不太大，热激蛋白合成的速度会很快下降，恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌，发酵过程一般分为生长和表达两个阶段，分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失，进而减少重组蛋白量。
综上所述，与细菌生长密切相关的条件有发酵系统中的培养基的成分、溶解氧、pH值和温度等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。