10.2.2 转基因动物技术的新发展
1.精原干细胞介导法
精原干细胞是哺乳动物睾丸内具有高度自我更新和分化潜能并具有生精能力的一类细胞。该技术流程为：①体外培养精原干细胞过程中摸索最佳的DNA转染条件；②对转染外源基因的阳性精原干细胞进行筛选；③通过受精获得整合位点不同的转基因动物。该方法大大提高转基因效率，且简单易行，为转基因动物的制作提供了一个极佳的思路，也是近年来转基因动物研究领域的热点之一。2008年，Kanatsu-Shinohara等首次利用精原干细胞种间移植技术获得了转基因大鼠后代。
2.转座子介导法
转座子是基因组上一段可以自由跳跃的DNA序列，首先由Mc Clintock于20世纪40年代在玉米染色体中发现，后又陆续在细菌、真菌、昆虫和哺乳动物等多种生物中发现。DNA转座子的转座过程遵循“剪切—粘贴”的机制在基因组上进行移动，因此以转座子介导的外源基因转移技术在制备转基因动物方面得到广泛应用，其中以Sleeping Beauty（SB）转座子和PiggyBac（PB）转座子为代表。该方法整合效率高且单拷贝整合，可以携带多个外源基因，易于模拟内源基因的表达，同时还容易确定整合位点，成为生物基因功能分析的有效途径之一。丁异等用PB转座子系统成功培育出带有荧光的转基因小鼠，从而首次建立一种高效的哺乳动物转座系统；Wu等还利用PB转座子与Cre-loxP系统相结合获得大量转基因突变体，并进行了广泛的功能基因研究。
3.诱导多能干细胞技术
通过导入外源基因的方法使体细胞去分化成为多能干细胞，这类干细胞称为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。2006年，Takahashi等将四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的组合转入分化的小鼠成纤维细胞中，使其重编程而得到一种类似于胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的iPS细胞。随后也成功诱导了猪、牛、绵羊等的iPS细胞。该技术为干细胞以及转基因动物的研究提供了全新的思路。可以将iPS细胞诱导技术和转基因技术结合起来，即利用iPS细胞作为核供体细胞，结合适当的受体细胞融合后获得转基因动物，可以很大程度上弥补大家畜ES细胞难以建系和克隆效率低等不足。同时，iPS技术也是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。
4.基因靶位技术
利用基因靶位技术可以对目的基因进行定点修饰，改造基因特定位点，更精确地调控外源或内源基因的表达，故该技术一直是转基因动物研究的热点之一。近年来更是涌现了不少如RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术、锌指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）技术、TALEN技术、CRISPR干扰（CRISPRi）技术等重要的新技术，使转基因动物的研究产生了历史性的飞跃。
利用RNAi技术，可以部分地抑制特定内源基因的表达或通过mRNA的降解来下调沉默目的基因。相对于传统的基因敲除方法来说，它具有操作简单、特异性强、高效和周期短等优点，可以作为一种简单、有效的替代基因敲除的工具来生产转基因动物。
ZFN由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成（一般3～4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN，以及部分GNN和TNN三联体，多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组而识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合于设计ZFN。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokⅠ的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。Fok Ⅰ是来自海床黄杆菌的一种限制性核酸内切酶，只在二聚体状态下才有酶切活性，每个Fok Ⅰ单体与一个锌指蛋白相连而构成一个ZFN，识别特定的位点。当两个位点相距恰当的距离（6～8 bp）时，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到DNA定点剪切的目的。
ZFN技术的出现使基因打靶技术发生了质的飞跃，它使基因打靶的效率由原来的10-7～10-6提高到10-2～10-1，已在动物的细胞水平和整体水平实现了基因的精确修饰，而且操作简单，缩短生产转基因动物的时间，应用范围更广，是一种比较理想的转基因技术。
TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技术是通过对DNA识别的TALEN臂和人工改造的核酸内切酶的切割域（FokⅠ）的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TALEN的DNA识别域由非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块由34个氨基酸残基组成，其中第12位和第13位的氨基酸残基种类是可变的，且决定该模块识别靶向位点的特异性。DNA识别域结合到靶位点上，与Fok Ⅰ的切割域形成二聚体后，可特异性对目的基因DNA进行切断。在非同源末端连接修复过程中，DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目的基因功能缺失。
TALEN技术和ZFN技术类似，可以介导内源基因的敲除或外源基因的定点敲入，对复杂基因组进行精确的修饰。不过与ZFN技术相比，TALEN技术更容易设计，能够实现大规模、高通量的组装，具有更高的DNA序列识别特异性，毒性和脱靶效应更低。该技术的使用可以极大地提高对家畜进行基因靶向修饰的效率。
CRISPRi技术利用靶向干扰外源DNA的cr-RNAs，将调控真核生物和原核生物进程的各类小RNA分子连接在一起，能同时抑制多个靶基因，且不会出现脱靶效应，比ZFN技术或TALEN技术更易于操作，有更强的扩展性，是一种更简便、更安全的哺乳动物基因组编辑新方法。