8.3.3　一类稳定转化的昆虫表达系统

1984年，日本学者Maeda以家蚕核型多角体病毒（BmNPV）为载体，在家蚕中成功表达了人α-干扰素，其表达量要比当时其他真核表达系统高出1000倍，由此开发出一类稳定、高效的昆虫表达系统。BmNPV表达系统（图8-9）与其他动物病毒载体表达系统相比，具有如下优点：①多角体蛋白编码基因的强启动子可使外源基因获得高效表达；②杆状病毒对于脊椎动物和其他昆虫是安全的；③双链环状的病毒基因组结构易于重组操作；④表达产物的修饰加工系统接近于哺乳动物；⑤重组BmNPV分子不仅能在细胞培养物中表达，更主要的是能在蚕体内合成蛋白质，由于家蚕血淋巴中含有蛋白酶抑制剂，表达产物相对稳定。

构建家蚕生物反应器，首先需要将重组病毒载体注入5龄幼虫体腔内，也可将携带外源基因表达盒的重组质粒与线形化处理后的野生型家蚕病毒基因组混合注射。在家蚕体内，通过重组质粒与病毒基因组同源重组并环化获得具有感染和增殖能力的重组病毒。因为重组核型多角体病毒具有独特的结构特点，与野生型病毒相比其感染能力相对较弱，如果经口感染家蚕，难以达到理想的效果，所以目前都是通过人工直接经皮注射来感染家蚕幼虫，难以实现自动化操作。因此，提高重组病毒的经口感染率，对于杆状病毒表达系统的规模化生产具有重要意义。目前效果较好的方法是利用荧光增白剂VBL与家蚕重组植酸酶病毒混合来增强家蚕重组病毒经口感染的效率，荧光增白剂可导致中肠上皮细胞结构和生理功能异常，引起重组杆状病毒经口感染效率显著提高。

图8-9　BmNPV系统表达外源基因示意图

（引自张惠展，2005）

家蚕生物反应器自1984年由日本的Maeda等开发以来，已经有许多外源基因在该表达系统中进行了表达，成为继大肠杆菌、毕赤酵母、中国仓鼠卵巢细胞之后的第四大重要表达系统。1996年日本利用家蚕生物反应器生产猪生长激素和鸡新城疫疫苗。中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、浙江大学及兰州生物制品研究所合作利用家蚕生物反应器生产乙肝表面抗原疫苗。目前已在家蚕内表达的外源蛋白有人α-干扰素、人白介素3、人白介素4、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）、人凝血因子Ⅷ、天花粉蛋白、流感疫苗、乙肝表面抗原、丙肝抗原蛋白、HIV-1、日本脑炎病毒膜蛋白gp120和gp41、人嗜T淋巴细胞1型乳头瘤病毒（HTLV-1）结构蛋白p40X、腺病毒蛋白Ela、牛1型乳头瘤病毒（BPV-1）蛋白E2和E6、人乳头瘤病毒6b蛋白E2、人脱辅基蛋白A和E、人尿激酶原（pro-UK）、人促红细胞生成素（EPO）、人成骨蛋白（BMP2）、日本血吸虫谷胱甘肽S转移酶、碱性蛋白酶抑制剂、浙江蝮蛇神经生长因子、禽马立克氏病毒糖蛋白B抗原、鸡传染性法氏囊病毒VP2抗原蛋白、类胰岛素生长因子以及植酸酶等。