3.6.1 腺病毒
1953年,腺病毒(adenoviruses,Ads)在人体脂肪组织中被首次发现。可以感染人的Ads被分为6种亚型(A~F),包含超过100种不同的血清型。研究发现这些已知的Ads种类中,最适于开发成基因载体用于基因转移和基因治疗的病毒包括Ad2、Ad5和C类病毒。
1.Ads结构
(1)衣壳:腺病毒无被膜结构,颗粒直径为70~100 nm(图3-26)。病毒外表由衣壳蛋白组成,呈二十面体的球形。在每个五面体交界的顶端含有由三聚体蛋白组成的纤丝,每个纤丝的末端形成球形结构域。衣壳内包裹着线状双链DNA分子。

图3-26 腺病毒结构
(引自James N.Warnock,2011)
(2)基因组:Ads基因组由长度为26~40 kb的线状双链DNA分子组成。病毒dsDNA在衣壳内被包装成核小体样的结构,在DNA分子两端含有103 bp反向重复序列。整个基因组含有两个主要转录区域,即早期转录区域和晚期转录区域。早期转录区域含有四个重要的转录单元(E1、E2、E3和E4),各转录单元的功能见表3-1。
表3-1 腺病毒早期转录单元的功能

2.生命周期
腺病毒感染宿主细胞的早期是指从病毒和宿主细胞相互接触到病毒DNA开始复制的阶段(图3-27)。在此过程中,病毒纤丝末端的球形节结构对人体各种细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)有很高的亲和性。当病毒靠近宿主细胞表面时,病毒和受体结合,病毒导入过程被启动。病毒衣壳五面体基部蛋白和宿主细胞第二受体相互作用可以增强纤丝和CAR间的亲和力。利用受体介导的细胞内吞作用,病毒穿过宿主细胞膜。当病毒释放到宿主细胞质后,病毒DNA被释放出来并进入宿主细胞核。

图3-27 腺病毒感染宿主细胞过程
(引自James N.Warnock,2011)
病毒基因组进入宿主细胞核后病毒DNA开始转录。此时,早期转录单元内的E1A单元开始转录,不久E1B开始转录。这两个转录单元的产物为病毒基因组的深入转录做准备,并促进宿主细胞进入S期,抑制宿主细胞凋亡。随后,E2单元开始转录,编码病毒DNA复制所必需的蛋白质,包括DNA聚合酶、终端前蛋白和DNA结合蛋白。紧随其后,E3单元开始表达,其表达产物阻止宿主对病毒入侵作出反应。最后,E4单元开始转录,产生一系列DNA复制、mRNA转运及加工所需要的蛋白质。
病毒DNA开始复制标志着开始进入病毒感染晚期。首先,病毒基因组两端的末端重复序列(ITR)开始复制。结合在病毒基因组两端的末端蛋白发挥DNA引物的作用。当一段较大的后期启动子的20 kb区段开始转录后,后期转录产物开始表达。转录产物先经过几次切割作用,产生编码五种蛋白质的mRNA。这些蛋白质随后产生病毒衣壳,并有可能参与子代病毒的组装过程。子代病毒组装完成后,宿主细胞最终会被裂解,释放出子代病毒颗粒。
第一代腺病毒载体是在基因治疗实验中使用最为广泛的载体。这些载体主要以Ad2、Ad5和C类腺病毒为基础构建,为了使载体可以承载更长的外源DNA,其基因组的E1或E1和E3转录单元被删除。经过改造的腺病毒载体可以承载大约7.5 kb的外源DNA片段。另一种在基因治疗中所使用的腺病毒载体称为“gutted”(完全改造)载体,其腺病毒基因组全部被删除,仅保留ITR和包装信号。此类载体的外源DNA承载量可以达到36 kb。
3.基因治疗应用研究
腺病毒载体的优势使其在基因转移和基因治疗方向的应用越来越普遍,但有些缺点阻止了腺病毒载体的大规模应用。表3-2中列举了腺病毒载体的优点和缺点。
表3-2 腺病毒载体的优点和缺点

腺病毒载体是在癌症治疗研究中最常用的病毒载体。有研究利用腺病毒将肿瘤抑制基因p53和p16成功地导入肿瘤组织中。这项研究首次证实腺病毒介导的p53基因治疗策略是一种有效的肿瘤治疗方法。自杀基因疗法和药物前体疗法也是利用病毒进行癌症基因治疗的研究方向。自杀基因疗法是利用病毒的蛋白质将无毒性的药物前体转化成为有毒性的药物,从而导致癌细胞死亡的治疗策略。目前,用于治疗前列腺癌的自杀基因疗法的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验已经完成。这一治疗过程利用删除E1和E3转录单元的复制缺陷型腺病毒载体(CTL102)完成,病毒载体携带CB1954药物前体和硝基还原酶重组的DNA片段进入患者体内。研究结果表明,接受治疗的患者体内的前列腺特异性抗原(PSA)不同程度下降,治疗过程增加了T细胞识别PAS的概率,而且这种治疗策略激发了肿瘤特异性免疫反应。
由于腺病毒载体具有感染非分裂细胞的能力,而且进入机体后可以在肝细胞中保持较高的浓度,因此腺病毒已经用于多种肝脏疾病的基因治疗研究。例如,有研究利用大鼠作为动物模型,通过腺病毒介导PAI-1的干扰RNA(siRNA)进入细胞,以治疗肝脏纤维化。重组载体纠正了肝细胞内基质金属蛋白酶及其抑制因子的水平,同时抑制肝细胞扩增和凋亡,组织学和免疫组织化学的研究结果表明导入腺病毒载体的大鼠肝脏纤维化程度显著降低。此外,腺病毒还用于针对干细胞分化、艾滋病治疗、心血管疾病和肺结核等疾病的治疗研究。