4.7.3 凝胶阻滞实验
1.凝胶阻滞实验的原理
凝胶阻滞实验，又叫做DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（band retardation assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。电泳时，裸露的DNA分子向正极移动的距离同其相对分子质量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于相对分子质量增大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正极移动的距离也就相应缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理（图4-20）。
2.凝胶阻滞实验过程
（1）首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中有某种特殊的转录因子）。
（2）用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）。
（3）这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是有可能产生DNA-蛋白质复合物。
（4）在使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（5）电泳结束后进行放射自显影，分析电泳结果。
3.凝胶阻滞实验结果的分析
如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在能与探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物含有可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。
图4-20 凝胶阻滞实验原理
4.凝胶阻滞实验的应用
（1）凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子的结合位点）序列结合的转录因子蛋白质。
（2）DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位。
（3）通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变，可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响。
（4）可以利用DNA同特定转录因子的结合作用分离特定的转录因子。