4.2.6 凝胶电泳片段的回收与纯化

4.2.6 凝胶电泳片段的回收与纯化

1.DNA片段的琼脂糖凝胶电泳回收与纯化

琼脂糖凝胶电泳是DNA片段分离、鉴定、纯化和回收的常用方法,主要有以下几种。

(1)柱试剂盒回收法:这是目前最简单、快速的回收方法。电泳结束后将凝胶中的产物条带切下,用溶解缓冲液溶解、上纯化柱、离心,再洗涤一次,离心后用洗脱缓冲液洗脱,即可获得回收产物,得到的产物可直接用于后续实验。该方法结果稳定,该方法不适用于大片段的回收。

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图4-4 双向电泳示意图

(2)玻璃奶/纯化填料胶试剂盒回收法:该方法比柱试剂盒回收法更灵活,可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量,使得实验不受限于柱子的载量,也不会造成浪费。该方法适合于各种大小的片段,特别是大片段的回收,但是操作就较前者复杂一些。

(3)低熔点琼脂糖法:这是传统手工操作方法之一,低熔点琼脂糖电泳后切割目的条带、熔化,用传统的酚-氯仿抽提,乙醇沉淀。该方法需时较长,现在已经不多用。

(4)透析袋电洗脱法:切下的条带放在充满TAE的透析袋中电泳,让DNA“走”出凝胶,加入溶液中,再采用反向电泳将附在透析袋上的DNA“赶”回溶液中,取溶液部分用传统方法酚-氯仿抽提沉淀。该方法只有在万不得已、针对非常大的片段回收时才考虑,也是聚丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一。

(5)DEAE纤维素膜纸片法:这是早期实验室最常用的方法之一,将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀,将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口,不留气泡,继续电泳一会儿,条带上的DNA被膜片截留,取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液洗脱,将洗脱液用酚-氯仿抽提沉淀,该方法不适合于较大的DNA。

2.DNA片段琼脂糖凝胶电泳回收与纯化方法的选择

凝胶电泳片段回收与纯化的好坏直接影响后续实验的成功与否。要想做好胶回收,要从回收质量(回收产物的纯度和浓度)、回收效率、操作方便程度(速度)、柱子的载量等方面来综合考虑,进行方法选择。

(1)回收质量:主要指纯度,对于大片段回收,质量还包括产物的完整与否,而对于较小片段回收,质量还包括回收产物的浓度。普通级别的琼脂糖往往含有性状不明的多糖,会连同DNA一起从凝胶中抽提出来,强烈抑制后续的连接、酶切等实验。在大片段回收时,特别要注意机械剪切力对回收产物大小的影响。对于较小片段的回收,产物浓度不能太小,否则对后续连接、标记实验等有影响。

(2)回收率:这是回收的另一个重要参数。回收时尽可能多地回收目的片段,提高产物的量。回收率通常和样品的大小以及量的多少有关,DNA片段越大,和固相基质的结合力越强,就越难洗脱,回收率越低;DNA的量越少,相对损失越大,回收率越低。因此,根据情况选择不同的方法是很重要的。

(3)操作:在产物质量与回收率得到保证的前提下,尽量选择操作简单、快速、应用起来方便的方法或者产品。

(4)载量:指每次回收最多能回收的产物的量。载量越大越好,因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质,过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。需要回收比较大量的产物时,大载量就很有优势。

一般情况下,常规片段级(DNA片段为100 bp~10 kb)与小片段级(DNA片段小于100 bp)回收主流方法是柱试剂盒回收法;大片段级(DNA片段大于10 kb)可选方法是玻璃奶/纯化填料胶试剂盒回收法与透析袋电洗脱法等。

3.DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳回收与纯化

从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA片段条带的凝胶块切出后压碎,用洗脱缓冲液浸泡使DNA浸出,通过沉淀、离心获得。该法能较好回收小于1 kb的单链或者双链DNA,且纯度高,回收产物不含酶抑制剂及对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物,是回收小片段DNA的较好方法。依相对分子质量不同,其回收率在30%~90%。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中,再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电洗脱,可以缩短双链DNA的回收时间。