3.2.2 质粒载体必须具备的基本特征
1.自主复制性
质粒载体的自主复制性由载体上特定的复制起始位点（ori site）控制，保证了质粒载体和其所携带的外源DNA在受体细胞的传代和细胞增殖过程中稳定存在。由于质粒载体最初是在大肠杆菌细胞中提取，而且基因工程操作始终离不开大肠杆菌这种方便的扩增系统，因此载体序列中至少应含有一种适合在特定大肠杆菌中进行复制的起始位点，例如，pUC系列载体结构中的pUC ori。而穿梭载体需要在不同种类细胞（如不同细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等）中具备自主复制能力，因此，载体中除含有在细菌细胞复制起始位点，还会引入其他宿主细胞的复制起始位点，如pcDNA3.1系列中除了含有pUC ori外，还含有SV40 ori和fl ori。SV40 ori为SV40病毒的复制起始位点，可以引导质粒在哺乳动物细胞中进行复制；fl ori为fl噬菌体的复制起始位点，在细菌中有辅助噬菌体存在条件下可以引导单链（ssDNA）复制。
2.多克隆位点
多克隆位点（multiple cloning site，MCS）是质粒载体上人工合成的一段序列，含有多个单一限制性核酸内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。不同的载体，其MCS内切酶识别位点数目不同，如最早用于基因克隆的pBR322质粒只有两种位于不同区域的酶切位点可选，经重新设计的质粒载体通常含有更多可供选择的酶切位点，而且这些位点都位于特定的一个区域内，这个区域称为多克隆位点区域，例如pcDNA3.1系列载体提供了17种可选的酶切位点。MCS作为基因工程操作的重要工具，为插入外源DNA提供了极大的方便。
3.遗传标记基因
基因工程载体中通常会插入一种或多种遗传标记基因，这些标记基因承担多种功能，其中，最重要的功能是筛选受体细胞是否摄入载体，即筛选转化子，如各种抗生素抗性基因；部分遗传标记基因会指示受体细胞摄入的载体是否插入了外源DNA，即筛选重组体，如β-半乳糖苷酶α片段基因（lac Z'）；特定遗传标记基因还可以赋予载体特定功能，如pGL3系列载体中的荧光素酶标记基因（luciferase gene）可以用来鉴定基因启动子的活性水平。
载体上的抗生素抗性基因会赋予导入载体的宿主细胞对特定抗生素的抵抗能力，此外营养标记基因配合特定的营养缺失型宿主细胞也可以发挥类似的功能，如酵母细胞转化筛选中常用的组氨酸（His3）、亮氨酸（Leu2）和色氨酸（Trpl）营养标记基因，使摄入了载体的营养缺陷型受体细胞可以在缺乏特定氨基酸成分的条件培养基内合成缺失的氨基酸，从而保证宿主细胞正常生长和增殖。抗性筛选标记和营养缺陷型筛选标记可以统一称为选择性标记。此外，基因工程载体中还可能插入非选择性标记，如β-半乳糖苷酶α片段基因（lacZ'）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）等，这些非选择性标记可以通过特定的组织化学方法进行鉴定，可以赋予载体特定的功能。
4.启动子
启动子是RNA聚合酶起始转录所结合的位点，为了引导载体上所携带的筛选标记基因或外源基因有效表达，在构建载体过程中会加入启动子，而且一种质粒载体中往往含有多种不同功能的启动子引导不同的基因表达，人工设计的两个基因的融合启动子也会发挥更高的启动活性。例如，一些载体里含有tac启动子，这是一种lac和trp启动子的融合启动子；pcDNA3.1系列载体中，巨细胞病毒启动子（CMV promoter）可以引导外源基因在真核细胞中高效表达，SV40病毒启动子可以引导新霉素抗性基因在真核细胞中高水平表达，Bla启动子可以引导氨苄青霉素抗性基因（Ampr）在细菌细胞中高效表达，噬菌体T7和SP6启动子可以在体外条件下引导外源DNA转录出mRNA。
5.较小的相对分子质量
通常认为，较小的质粒更适合作为基因工程载体。小相对分子质量的质粒更容易操作，也更有利于插入更大的外源DNA片段，更容易进入宿主细胞，增加细胞转化的成功率；小相对分子质量的质粒通常含有较高的拷贝数，更便于质粒DNA提取制备；此外，小相对分子质量的质粒会增加载体内单酶切位点存在的概率。多数常用的基因工程载体的大小在4～6 kb范围内。一般来说，质粒载体不要超过10 kb，超过20 kb大小的质粒很难进入宿主细胞。